中華鱘TaqMan 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的建立

陳光哲， 鄭紅霞, 祝長青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210095； 3.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001)

鱘類是現(xiàn)存起源最早的脊椎動(dòng)物之一，是一億五千萬年前中生代留下的稀有古代魚類，其被譽(yù)為研究魚類和脊椎動(dòng)物進(jìn)化的“活化石”。在中國境內(nèi)，分布著一些野生鱘魚，其中中華鱘是中國特有的珍貴鱘類，具有重要的科學(xué)價(jià)值和難以估量的生態(tài)、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有“水中大熊貓”之稱[1-5]。但是，近年來，由于水域污染、人為捕撈、水利工程的建設(shè)以及資源的過度開采等原因?qū)е铝酥腥A鱘的數(shù)量急劇減少。中國已經(jīng)將中華鱘列入《國家重點(diǎn)保護(hù)水生野生動(dòng)物名錄》，并按照一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物實(shí)施保護(hù)。2010年，國際自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名錄也收錄其為極危物種[6-9]。因此，保護(hù)中華鱘迫在眉睫，而建立快速、靈敏、特異的中華鱘及其產(chǎn)品的檢測(cè)鑒定方法是保護(hù)和拯救這一珍稀瀕?！盎罨钡挠行Ъ夹g(shù)措施之一。

近幾年來，一些水生生物的物種鑒定方法陸續(xù)在國內(nèi)外研究中被報(bào)道，主要包括形態(tài)學(xué)鑒定[10]、同工酶電泳分析[11]、染色體組型分析[12]、COI基因分析[13]等。這些方法雖已被運(yùn)用于多種水生生物的鑒定，但是在實(shí)際應(yīng)用中仍然具有一定的局限性。形態(tài)學(xué)、同工酶鑒定等方法由于受到檢測(cè)對(duì)象需為活體條件的限制，無法應(yīng)用在水產(chǎn)加工產(chǎn)品上；染色體組型分析、COI基因分析等方法也存在操作繁瑣、耗時(shí)過長等不足[10-13]。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),Polymerase chain reaction)技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)脫穎而出，在近幾十年被全世界許多科研機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室所采用。尤其是實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，既可省去普通PCR 檢測(cè)過程中PCR 產(chǎn)物后續(xù)的分析與驗(yàn)證步驟(如凝膠電泳和探針雜交)，簡化檢測(cè)過程，又能夠減少試驗(yàn)操作過程中的EB (溴化乙錠Ethidium bromide)污染，使試驗(yàn)更具安全性，同時(shí)邊擴(kuò)增邊檢測(cè)，還可以提高檢測(cè)速度[14-16]。因此，與常規(guī)PCR 相比，實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、可有效解決PCR 污染等優(yōu)勢(shì)[17-18]，已成為一種成熟的主流基因檢測(cè)平臺(tái)，并且應(yīng)用在諸多領(lǐng)域，如食品安全檢驗(yàn)、食品成分來源檢驗(yàn)[19]等。

本試驗(yàn)根據(jù)NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心，National center for biotechnology information)上已經(jīng)公布的中華鱘D-loop基因的核酸序列，設(shè)計(jì)并篩選出特異性的引物和探針，建立中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，為中華鱘的物種鑒定及種質(zhì)資源保護(hù)提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 中華鱘供試樣品為漁業(yè)保護(hù)部門提供；西伯利亞鱘、達(dá)氏鱘、史氏鱘購自鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)，其他用于對(duì)照試驗(yàn)的動(dòng)物種類購自于南京農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)(表1)。

表1供試樣品的種類

Table1Speciesofsamples

序號(hào)樣品名稱序號(hào)樣品名稱序號(hào)樣品名稱序號(hào)樣品名稱1中華鱘13螃蟹25雞肉37蚌仔2史氏鱘14黃鱔26叉尾鮰魚38毛蚶3西伯利亞鱘15帶魚27梭魚39文蛤4河豚16黃顙魚28牛蛙40斑節(jié)蝦5蚌17鱸魚29螯花魚41小青龍蝦6牙鲆18魷魚30鯧魚42單環(huán)刺縊7斑馬魚19豬肉31黑魚43梅蛤8鱉20牛肉32黃魚44大閘蟹9鯉魚21羊肉33鳊魚45蝦蛄10河蝦22鴨肉34青魚46青蟹11對(duì)蝦23江白蝦35海蟹47梭子蟹12鯽魚24花蟹36香螺48克氏原螯蝦

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 pMD19-T克隆載體和感受態(tài)細(xì)胞DH5α，南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 Tiangen海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit，目錄號(hào)：DP324)， Tiangen瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANamp Agarose Gel DNA Purification Kit，目錄號(hào)：DP209)， AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，目錄號(hào)：AP-MN-P-50)，普通PCR預(yù)混液SapphireAmp Fast PCR Master Mix(寶生物有限公司產(chǎn)品)，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液CS qPCR Master Mix(上海輝睿生物科技公司產(chǎn)品)，中華鱘基因引物及探針(上海輝睿生物科技公司產(chǎn)品)。

1.1.4 儀器 NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司產(chǎn)品)，AQE -183-2全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司產(chǎn)品)，LightCycler 480 II實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(Roche公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 使用Tiangen海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取中華鱘及對(duì)照生物的DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上公布的中華鱘D-loop基因序列設(shè)計(jì)引物探針組合，上游引物F：5′- CAAGAACACAAGATTAATGAG -3′,下游引物R：5′- GATCAAGGTATGTCGATGACA -3′，熒光探針P：5′- 熒光基團(tuán)-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-淬滅基團(tuán)-3′，熒光基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為BHQ1。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 以中華鱘DNA為模板，利用引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，將目的DNA片段經(jīng)TA克隆連接至pMD19-T載體中，得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α內(nèi)增殖，篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，取約100 μl陽性克隆菌液送南京鐘鼎生物技術(shù)公司測(cè)序，以確定克隆片段序列的準(zhǔn)確性。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，根據(jù)下列公式計(jì)算拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=(質(zhì)粒質(zhì)量×6.02×1023)/(質(zhì)粒分子堿基對(duì)數(shù)×324.50×2.00)。

1.2.4 TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為10 μmol/L上游引物1.0 μl，10 μmol/L下游引物1.0 μl，10 μmol/L探針0.6 μl，50 ng/μl DNA模板2.2 μl,2倍熒光PCR緩沖液12.5 μl，去離子水9.0 μl。反應(yīng)體系終濃度為1倍熒光PCR緩沖液，上游引物0.40 μmol/L，下游引物0.40 μmol/L，探針0.24 μmol/L。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)；40 ℃冷卻 30 s。反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用配套軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 特異性評(píng)定 以中華鱘及對(duì)照生物的DNA為模板，并設(shè)置空白對(duì)照，進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。

1.2.6 靈敏度測(cè)定

1.2.6.1 核酸濃度 以濃度為1.0×10-5ng/μl、 1.0×10-4ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-1ng/μl 的中華鱘DNA為模板，設(shè)置空白對(duì)照，進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。

1.2.6.2 重組質(zhì)粒 以每1 μl拷貝數(shù)達(dá)到1個(gè)拷貝、101個(gè)拷貝、102個(gè)拷貝、103個(gè)拷貝、104個(gè)拷貝的重組質(zhì)粒DNA為模板，并設(shè)置空白對(duì)照，應(yīng)用建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.7 TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證 將本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于全國多個(gè)省市采集的63個(gè)鱘魚樣品，以驗(yàn)證該方法的特異性和靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行克隆與測(cè)序，克隆片段序列與NCBI上中華鱘的D-loop基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出長度為489 bp的中華鱘D-loop基因，并且擴(kuò)增片段成功與質(zhì)粒載體連接形成長度為3 181 bp的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒克隆片段測(cè)序結(jié)果如下：GATCAAGGTATGTCGATGACAAGTCAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAGAAATATAGGGCCTGTCCGACATAAGGGGGTAGGGGGTTTGTCGACAATAAACGCCCGCACCTCGAAGTTCATGTGGGGAGGCAAAATCAGGTCTTGTAAAACACTCTCATGTGTGGATGTTAGATATATGTCCTTGCATCATTCATTATTCATTCCTCCGAGCAGTTGTGTAATGTTCTACCTTGTTGTTCTTTTCTGAAGGAGTTCTACATGTCAGTGAATGGAAACCCAGATTAAAAGTGCCAAATGTTGACAAGATTCTTGGCATGTGGGGTCATGGATTTTACAGTATTTTTAACATCAATCATATGCCAGACATAGTTCAGTTATGGGGAGTTTAACTATTAATGGGCCTGAGATAGAAGCCAAATGCCAGTAATAGTTCAATTTTAGGTCTTTTACAGGTACTGTCCTTCATCTCATTAATCTTGTGTTCTTG提取的重組質(zhì)粒DNA利用NanoDrop 1000 微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，DNA的A260/A280平均值為1.77，DNA的平均濃度為2 789.3 ng/μl。重組質(zhì)粒DNA的濃度稀釋至28.0 ng/μl，根據(jù)公式計(jì)算拷貝數(shù)，相當(dāng)于1 μl溶液中含有 8.16×109拷貝重組質(zhì)粒DNA，用超純水將重組質(zhì)粒溶液稀釋成1 μl 108個(gè)拷貝， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 特異性

F-R-P引物/探針組合對(duì)試驗(yàn)所檢測(cè)各物種的特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)使用引物和探針組合F-R-P對(duì)48種DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，只有在中華鱘的DNA樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而在其他物種中沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。因此建立的中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法具有高度的特異性。

2.3 靈敏度

2.3.1 核酸濃度 應(yīng)用建立的中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)倍比稀釋的中華鱘DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果顯示中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)到1.0×10-3ng中華鱘DNA。

表2中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR體系的靈敏度(核酸濃度)的Ct值

Table2TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(theconcentrationofnucleicacids)

NDA質(zhì)量(ng)Ct值0．1000029．360．0100032．750．0010034．770．00010-0．00001-空白對(duì)照-

2.3.2 重組質(zhì)粒 應(yīng)用建立的F-R-P檢測(cè)體系對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行靈敏度的檢測(cè)，擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果顯示中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)到100拷貝的重組質(zhì)粒DNA。

2.4 檢測(cè)方法的驗(yàn)證

將本研究建立的中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于全國多個(gè)地區(qū)采集的63個(gè)鱘魚樣品中，檢測(cè)結(jié)果顯示：許多餐館中號(hào)稱的“中華鱘”其檢測(cè)結(jié)果不是真正的中華鱘，而只是其他的一些鱘魚品種。其中7個(gè)從相關(guān)科研單位得到已經(jīng)鑒定的中華鱘標(biāo)本，經(jīng)檢測(cè)才是真正的中華鱘，檢測(cè)曲線圖譜如圖1所示。

表3中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR體系的靈敏度(重組質(zhì)粒)的Ct值

Table3TheCtvalueofsensitivityofTaqManreal-timePCRsystemforAcipensersinensis(recombinantplasmid)

重組質(zhì)?？截悢?shù)Ct值1000030．68100033．9910038．9510-1-空白對(duì)照-

圖1 部分鱘魚樣品的檢測(cè)曲線Fig.1 The amplification curves of some sturgeon samples

3 討 論

目前建立的中華鱘物種鑒定方法主要包括形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶電泳分析、染色體組型分析、COI基因分析等方法，然而上述方法均存在某些局限性，不能對(duì)中華鱘及其產(chǎn)品進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)。因此為給中華鱘提供及時(shí)而有效的保護(hù)，建立中華鱘及其產(chǎn)品的快速檢測(cè)方法是十分必要的。

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在近年來發(fā)展迅速，已成為目前應(yīng)用較為廣泛的一種檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中常用的熒光材料有SYBR Green染料、TaqMan探針、分子信標(biāo)、熒光共振能量傳遞(FRET)探針、復(fù)合探針等[20]。其中，TaqMan探針是一種水解寡核苷酸探針，其序列與目標(biāo)序列上下游引物之間的一段DNA模板完全互補(bǔ)，5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(Reporter)，3′端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)(Quencher)，每擴(kuò)增1條DNA鏈，就會(huì)有1個(gè)TaqMan探針被水解下來，并隨之釋放出一個(gè)熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的積累與PCR產(chǎn)物的增加是同步進(jìn)行的[20]。TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)能夠避免非特異性產(chǎn)物與探針的雜交，從而保證了檢測(cè)特異性[21]。目前該技術(shù)已經(jīng)在多種動(dòng)植物物種及其產(chǎn)品的鑒定方面得到了成功的應(yīng)用[22]。

D-loop區(qū)是線粒體基因組上DNA序列和長度變異最大的一段非編碼區(qū)，各個(gè)物種的D-loop基因具有較好的特異性[23]。本研究根據(jù)NCBI上公布的中華鱘D-loop基因序列，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)并篩選出相應(yīng)的引物和探針組合，經(jīng)過TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序，設(shè)計(jì)的引物和探針組合能夠特異、高效地?cái)U(kuò)增靶序列，擴(kuò)增產(chǎn)物(長度為489 bp)測(cè)序結(jié)果與 NCBI上中華鱘D-loop基因序列一致。

本研究所建立的中華鱘TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用于大量實(shí)際樣品后的試驗(yàn)結(jié)果均符合預(yù)期，充分證實(shí)了該方法可以應(yīng)用于中華鱘的物種鑒定，該檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高、可操作性強(qiáng)，具有較好的應(yīng)用和推廣價(jià)值，可以為中國中華鱘的鑒別以及物種資源保護(hù)工作提供可靠的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn):

[1] 王有基，袁明哲，吳芳麗，等． 長江流域中華鱘保育進(jìn)展、存在問題及對(duì)策分析[J]．生物學(xué)通報(bào)，2005，48(12) :1-5．

[2] HU J Y, ZHANG Z B, WEI Q W, et al. Malformations of the endangered Chinese sturgeon,Acipensersinensis, and its causal agent [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106: 9339-9344.

[3] 楊 志，陶江平，唐會(huì)元，等. 三峽水庫運(yùn)行后庫區(qū)魚類資源變化及保護(hù)研究[J]．人民長江，2012，43(10):62-67．

[4] 程金成，高 健，劉 健.中華鱘資源現(xiàn)狀及其保護(hù)對(duì)策探討[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2005(3):3-4.

[5] 常劍波，曹文宣.中華鱘物種保護(hù)的歷史與前景[J].水生生物學(xué)報(bào)，1999，23(6):712-719.

[6] 鄧 昕，鄧中磷.中華鱘的保護(hù)生物學(xué)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物學(xué)研究，1997，18(1):113-120.

[7] 胡小琴，姜翠玲，裴海峰，等.水環(huán)境變化對(duì)中華鱘的影響[J].水電能源科學(xué)，2009,27(3):35-37.

[8] 柯福恩.論中華鱘的保護(hù)與開發(fā)[J].淡水漁業(yè)，1999，29(9):4-7.

[9] 姜禮燔.環(huán)境污染對(duì)中華鱘AcipensersinensisGray 影響的研究[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息，1996，11(7):1-7.

[10] 魏開建，熊邦喜，趙小紅，等． 五種蚌的形態(tài)變異與判別分析[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2003，27(1):13 -18．

[11] 高保全，劉 萍，李 健，等． 三疣梭子蟹野生群體同工酶的遺傳多態(tài)性分析[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2007，31(1):1-6．

[12] GRAZYNA F S, FOPP B D, JANKUN M, et al. Note on the karyotype and NOR location of Siamese fighting fishBettasplendens(Perciformes, Osphronemidae) [J].Caryologia, 2008, 61(4):349-353.

[13] 柳淑芳，陳亮亮，戴芳群，等. 基于線粒體CO1基因的DNA條碼在石首魚科(Sciaenidea)魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用[J]. 海洋與湖沼，2010，41(2):223-231.

[14] 陳 旭，齊鳳坤，康立功，等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(8):148-155.

[15] OKUMA T A, HELLBERG R S. Identification of meat species in pet foods using a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay [J]. Food Control, 2015, 50: 9-17.

[16] K?PPEL R, BUCHER T, FREI A, et al. Droplet digital PCR versus multiplex real-time PCR method for the detection and quantification of DNA from the four transgenic soy traits MON87769, MON87708, MON87705 and FG72, andlectin[J]. European Food Research and Technology, 2015, 241(4): 521-527.

[18] PAN A, YANG L, XU S, et al. Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of MON863 maize based upon the 3’-transgene integration sequence [J]. Journal of Cereal Science, 2006, 43(2): 250-257.

[19] 吳永彬，肖維威，馬文麗. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊，2011，22(4):575-579.

[20] GOMEZ D K，SATO J，MUSHIAKE K，et al． PCR based detection of betanodaviruses from cultured and wild marine fish with no clinical signs[J]． J Fish Dis，2004，27(10):603-608．

[22] SCHOLTENS I M J, PRINS T W, RAAMSDONK L W D V．Specificity of a novel TaqMan PCR method for detection of poultry DNA [J].Food Control, 2017，73: 532-539．

[23] 黃志堅(jiān)，徐曉鵬，唐晶晶，等．淡水魚類線粒體DNAD-loop基因的引物設(shè)計(jì)和應(yīng)用[J]．中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，48(4) : 84-88．