EZH2與卵巢癌合并肺部感染患者化療鉑類耐藥的相關(guān)性及其機(jī)制

白艷鳳

組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)又稱為果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2，是多梳基因家族的重要一員，與細(xì)胞的分化、增殖等關(guān)系密切，在胚胎的早期發(fā)育中普遍存在[1-2]。越來越多的研究表明EZH2的表達(dá)水平與惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、卵巢癌等密切相關(guān)，但與其化療耐藥的相關(guān)性報(bào)道較少[3]。本文為分析探討EZH2與卵巢癌合并肺部感染患者化療鉑類耐藥的相關(guān)性及其機(jī)制，特進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本次實(shí)驗(yàn)所用的人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780及其鉑類耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP均由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑來源：PCR引物由上海英駿生物合成，Trizol試劑從美國Invitrogen公司進(jìn)口，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒及PCR反應(yīng)液由日本Toyobo公司進(jìn)口，熒光標(biāo)志物從北京中杉試劑公司購買，山羊血清及β-actin抗體(BM0627)從武漢boster公司購買，BCA蛋白測定試劑盒、IP和Western細(xì)胞裂解液均從碧云天公司購買，EZH2抗體(ab3748)由美國ABCAM公司進(jìn)口，LumiGLO發(fā)光物購于深圳晶美公司，酶標(biāo)記物IgG(H+L)由美國Pierce公司進(jìn)口。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)箱設(shè)定溫度為37 ℃、相對(duì)濕度為90%、CO2為5%，A2780采用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)貼壁生長；A2780/DDP培養(yǎng)箱設(shè)定條件同前，不同的是在兩代培養(yǎng)液中加入濃度為5 μmol/L的順鉑來維持耐藥性。

1.2.2 RT-PCR檢測EZH2mRNA及蛋白表達(dá) 提取各細(xì)胞的總RNA，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄說明書將其反轉(zhuǎn)為cDNA，應(yīng)用ABI 7300PCR定量儀行PCR反應(yīng)。EZH2內(nèi)參為GAPDH，下游引物為5-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3,上游引物為5-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3;設(shè)定PCR無模版陰性對(duì)照，在試驗(yàn)完成后作熔解曲線進(jìn)行分析以判斷產(chǎn)物是不是單一。重復(fù)本次試驗(yàn)3次。

1.2.3 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá) 將各細(xì)胞收集后應(yīng)用RIPA裂解法提取各細(xì)胞總蛋白，并應(yīng)用BCA法對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定。提取50 μg的總蛋白進(jìn)行分離并用硝酸纖維素膜封閉，加入β-actin單克隆抗體和EZH2單克隆抗體以500∶1的比例稀釋后加入二抗，1 h后用電化學(xué)進(jìn)行發(fā)光顯色?；叶确治鰬?yīng)用Quantity One 電腦軟件進(jìn)行分析，重復(fù)本次試驗(yàn)3次。

1.2.4 免疫熒光法檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá) 將收集的細(xì)胞數(shù)調(diào)整到24孔板內(nèi)，并置于相對(duì)濕度為90%、CO2為5%、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，選取適宜細(xì)胞行實(shí)驗(yàn)，先應(yīng)用PBS進(jìn)行洗滌，應(yīng)用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，時(shí)間為15 min，并用山羊血清進(jìn)行1 h封閉，封閉后加入EZH2抗體在培養(yǎng)箱中培育2 h，并在避光條件下加入熒光二抗繼續(xù)避光培育2 h，將顯微鏡倒置照相。重復(fù)本次試驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測EZH2mRNA及蛋白表達(dá)

經(jīng)PT-PCR檢測,EZH2 mRNA和蛋白在A2780細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為(0.68±0.19)、(0.10±0.02)，而在A2780/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為(1.12±0.21)、(0.22±0.10)，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 RT-PCR檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果

2.2 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)

經(jīng)Western檢測,EZH2 mRNA和蛋白在A2780細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為(0.67±0.16)、(0.11±0.04)，而在A2780/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為(1.20±0.212)、(0.24±0.12)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表2所示。

表2 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3 免疫熒光法檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)

經(jīng)過免疫熒光法檢測,EZH2 mRNA和蛋白在A2780細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為(0.71±0.13)、(0.14±0.11)，而在A2780/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為(1.31±0.34)、(0.28±0.15)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表3所示。

表3 Western檢測EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果

由此可見，3種試驗(yàn)方法均表明EZH2蛋白在A2780及A2780/DDP中的表達(dá)主要以核表達(dá)為主，且A2780/DDP的表達(dá)明顯高于A2780，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EZH2 mRNA的表達(dá)在A2789/DDP中較A2780增加更為顯著(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌是目前婦女常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著患者的生活質(zhì)量和生命安全[4]。目前對(duì)于卵巢癌臨床主要以手術(shù)治療為主，并進(jìn)行輔助化療，輔助化療雖可提高患者的總體反應(yīng)率和生存率[5]，但同時(shí)也帶來了多種耐藥現(xiàn)象而影響治療，因此，尋找一種逆轉(zhuǎn)耐藥以提高化療藥物敏感度的基因已經(jīng)成為了腫瘤患者及專家們的關(guān)注焦點(diǎn)[6-7]。EZH2持續(xù)激活可引起細(xì)胞的異常惡化增殖，因此被當(dāng)成是一種癌候選基因，且多種惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌及肝細(xì)胞癌等均被證實(shí)其EZH2表達(dá)水平增高[8]。有研究表明[9-10]EZH2基因的表達(dá)與化療鉑類耐藥性存在一定的相關(guān)性，它可特異性的通過位點(diǎn)將組蛋白上賴氨酸(位于27位，H3-K27)甲基化從而沉默抑癌基因轉(zhuǎn)錄及改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，使得癌細(xì)胞增殖并抑制凋亡。

本次研究為分析探討組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶與卵巢癌合并肺部感染患者化療鉑類耐藥的相關(guān)性及其機(jī)制，進(jìn)一步為臨床診治卵巢癌合并肺部感染患者提供相關(guān)的理論指導(dǎo)與依據(jù)，對(duì)人卵巢上皮性癌細(xì)胞株A2780、鉑類耐藥細(xì)胞株A2780/DDP分別采用免疫熒光法、RT-PCR及Western blot方法檢查其EZH2 蛋白及mRNA表達(dá)的水平差異，探討EZH2對(duì)上皮性癌細(xì)胞株A2780和鉑類耐藥細(xì)胞株A2780/DDP表達(dá)水平的差異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種試驗(yàn)方法均表明EZH2(組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶)蛋白在A2780及A2780/DDP中的表達(dá)主要以核表達(dá)為主，且A2780/DDP的表達(dá)明顯高于A2780，兩者比較差異性顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EZH2 mRNA的表達(dá)在A2789/DDP中較A2780增加更為顯著，兩者比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究顯示了EZH2(組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶)mRNA及蛋白在卵巢癌細(xì)胞A2780和耐順鉑細(xì)胞A2780/DDP中的表達(dá)水平的差異性，表明了EZH2與卵巢癌患者鉑類耐藥具有一定的相關(guān)性，但其具體作用機(jī)制是通過協(xié)同DNA阻斷細(xì)胞凋亡引起耐藥還是通過甲基化使癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥作用尚無法確定，還有待進(jìn)一步的分析研究[11-12]。

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