羅格列酮對肝癌HepG2細胞周期和凋亡的影響

康 燕 魏 玲 王永霞 王立云

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是1種全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，我國的HCC發(fā)病率占全球HCC人數(shù)的40%～45%，死亡率占我國惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8%，其發(fā)病率與死亡率均高，且預后較差[1-2]。臨床上，急需一種新型藥物或治療方法來提高其生存率，延長HCC患者的生存期。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)在許多癌癥細胞中均有所表達，是一類由配體[如羅格列酮(ciglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)等]激活的核轉(zhuǎn)錄因子，其中一些配體已經(jīng)被作為抗糖尿病的一類新藥在臨床上加以應用[3]。隨著醫(yī)學及生物學研究的不斷進步，有研究發(fā)現(xiàn)該類藥物還能夠激活PPARγ受體從而調(diào)控腫瘤細胞的生長，具有加速腫瘤細胞凋亡，抑制血管生成等的作用[4]。因此，本研究通過檢測不同濃度羅格列酮對肝癌HepG2細胞周期及凋亡率的影響，為羅格列酮應用于HCC的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用天津葛蘭素史克有限公司生產(chǎn)的羅格列酮(商品名：文迪雅，批號：05060018)；上海細胞資源中心提供的人肝癌細胞株HepG2和Bel-7404；Gibco公司生產(chǎn)的胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基及胰酶；Sigma公司生產(chǎn)的四甲基偶氮唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)；北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的PBS緩沖液(1×)、胰酶-EDTA混合液、青鏈霉素混合液(100×)；南京晶美生物技術公司生產(chǎn)的碘化丙啶(PI)。

1.2 儀器

日本三洋工業(yè)株式會社提供的SHEL-LAB2300 CO2培養(yǎng)箱；蘇州凈化集團安泰公司生產(chǎn)的SW-CJ醫(yī)用超凈臺；美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細胞儀；美國伯樂公司生產(chǎn)的Bio-RAD550全自動酶標讀數(shù)儀；日本Olympus公司生產(chǎn)的OLYMPUS倒置相差顯微鏡；Eppendorf公司生產(chǎn)低溫臺式離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)方法 人肝癌細胞株HepG2培養(yǎng)方法是將含有10%胎牛血清、1%青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)于常規(guī)培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫，飽和濕度5% CO2的條件下培養(yǎng)孵育，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，在細胞呈單層貼壁生長后，每1～2天更換1次培養(yǎng)基，然后取對數(shù)生長期的細胞用于本次研究。

1.3.2 分組 羅格列酮共設4個濃度組(10、25、50、100 μg/ml)，每孔加入相應濃度的羅格列酮，然后用2‰ DMSO溶解。實驗組為：培養(yǎng)液+細胞+不同濃度藥物；陰性對照組為：培養(yǎng)液+細胞。作用時間為12 h、24 h、48 h、72 h、96 h。

1.3.3 細胞增殖的檢測 采用MTT 法檢測細胞增殖。取對數(shù)生長期肝癌細胞HepG2以0.25%胰酶消化后配制成濃度是5×104/mL的細胞液，并接種于96孔培養(yǎng)板中，體積為100 μl/孔，正常培養(yǎng)貼壁后加藥處理，每個濃度設5復孔，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)液和細胞液。孵育12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，在每孔中加入0.5% MTT 20 μl，然后繼續(xù)孵育4 h后棄上清，再在每孔中加入DMSO 150 μl，并振蕩混勻，采用酶標儀測定每孔在570 nm處的吸光度(OD)，依據(jù)OD值來判定藥物對細胞增殖的影響程度。細胞生長抑制率(IR)計算公式為[5]：IR=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，并計算出IC50。

1.3.4 細胞周期與凋亡檢測 不同濃度羅格列酮處理HepG2細胞，同時設培養(yǎng)液+細胞為陰性對照組，于24 h后PBS洗滌后收集細胞，加入冰預冷的70%的乙醇于4 ℃固定1 h，離心棄固定液，PBS重懸5 min。300目篩網(wǎng)過濾1次，1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。用5 mg/mL RNA酶100 μL消化，100 μg/mL碘化丙啶避光染色30 min，上流式細胞儀檢測，Listmode軟件分析凋亡及細胞周期分布。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對肝癌HepG2細胞增殖的影響

表1、圖1顯示，不同劑量的羅格列酮作用不同時間均對肝癌HepG2細胞有很強的抑制作用，羅格列酮處理12 h、24 h、48 h、72 h及96 h時對肝癌HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別是53.9 μg/ml、73.8 μg/ml、41.6 μg/ml、91.4 μg/ml及104.9 μg/ml。因此，羅格列酮對肝癌HepG2細胞有較強的體外毒性，肝癌HepG2細胞活性隨著羅格列酮劑量和作用時間的增加而不斷下降，出現(xiàn)劑量-效應和時間-效應的關系。

圖1 不同濃度羅格列酮作用后對肝癌HepG2細胞生長的影響

2.2 羅格列酮對肝癌HepG2細胞周期與凋亡的影響

羅格列酮作用48 h后，肝癌HepG2細胞群分布于細胞的各個期，從表2看出，肝癌HepG2細胞G0/G1期比例明顯增高，S期細胞比例有所下降，到G2/M期時細胞的比例明顯下降，并呈顯著的劑量依賴性。因此，羅格列酮對HepG2細胞作用48 h后能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，且隨著羅格列酮濃度的升高凋亡率增多，對劑量產(chǎn)生一定的依賴性。

3 討論

細胞周期進程是受到細胞自身精密調(diào)節(jié)的。細胞周期分為G0/G1期﹑S期﹑G2期﹑M期4期。細胞在完成G1→S→G2→M的一次增殖過程中，在各期中存在著功能不同的檢測點，細胞周期檢查點對細胞周期按序正常進行起著重要作用，G0/G1和G2/M期檢查點是其中非常關鍵的檢查點[6-7]。本研究通過對細胞周期的分析結(jié)果顯示，羅格列酮作用48 h后，肝癌HepG2細胞群分布于細胞的各個期，肝癌HepG2細胞G0/G1期比例明顯增高，S期細胞比例有所下降，到G2/M期時細胞的比例明顯下降，并呈顯著的劑量依賴性。說明羅格列酮可導致肝癌HepG2細胞滯留在G0/G1期，對細胞向G2/M期移行有一定的抑制作用。

表1 羅格列酮對肝癌HepG2細胞的增殖抑制和毒性作用影響

表2 羅格列酮對肝癌HepG2細胞周期與凋亡的影響

注：*為與陰性對照組比較，P<0.05。

細胞凋亡是指受基因調(diào)控的程序性死亡過程，在維持機體環(huán)境穩(wěn)定時，多種基因控制細胞發(fā)生自主的、有序的死亡過程，因此也被稱為細胞程序死亡[8]。所以細胞凋亡過程涉及一系列的基因激活、表達及調(diào)控等，是一種機體為更好地適應自身的生存環(huán)境而積極發(fā)生的爭取死亡的過程[9]。但是在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，細胞凋亡減少與腫瘤細胞的過度增殖和異常分化有關。因此細胞凋亡調(diào)控異常在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著舉足輕重的作用。腫瘤防治的關鍵點就是抑制細胞的增殖和(或)促進細胞發(fā)生的凋亡[10-11]。而能否誘導細胞凋亡與誘導細胞凋亡的程度是評價抗腫瘤藥的重要關鍵性指標。本研究結(jié)果顯示，羅格列酮對肝癌HepG2細胞引起了明顯的細胞凋亡，并且因為藥物濃度的不同，細胞的凋亡率從13.4%到67.6%，同時呈時間依賴性及劑量依賴性。肝癌HepG2細胞的凋亡率可以隨羅格列酮濃度的增加而升高，因此，推測羅格列酮是通過改變細胞周期來誘導細胞發(fā)生凋亡的。

本研究采用MTT檢測羅格列酮對肝癌HepG2細胞生長及毒性的作用，結(jié)果顯示，不同濃度的羅格列酮處理對肝癌HepG2細胞不同時間的貼壁細胞有很強的毒性作用，在作用48 h后羅格列酮對肝癌HepG2細胞作用的IC50值均小于50.0 μg/ml。根據(jù)南美抗腫瘤藥物研發(fā)辦公室頒布的有關植物提取物抗腫瘤成分標準(體外實驗IC50< 50 mg/L的植物提取成分確定為有效抗腫瘤成分)[12]，顯示羅格列酮有較強的體外細胞毒性。本研究的結(jié)果表明肝癌HepG2細胞活性隨著羅格列酮劑量和作用時間的增加而下降，表明羅格列酮能明顯抑制肝癌HepG2細胞的生長，其作用具有時間和濃度依賴性。

綜上所述，羅格列酮能抑制肝癌HepG2細胞生長并促進其凋亡，這顯示了羅格列酮的潛在價值。

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