不同組分釉質(zhì)黏結(jié)劑對牙齦卟啉單胞菌和變形鏈球菌的影響

陸珮珺,李 晅

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔正畸科,上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室,上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所,國家口腔疾病臨床研究中心,上海 200011;2上海市口腔病防治院口腔正畸科,復(fù)旦大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程實驗室;*通訊作者,E-mail:queenlixuan@hotmail.com)

固定矯治是治療錯頜畸形的重要手段之一,臨床采用固定矯治的患者占半數(shù)以上。正畸治療中齲病及牙周炎性反應(yīng)是固定矯治過程中常見的并發(fā)癥[1-5],嚴重者需中斷矯治。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是牙周病公認的證據(jù)充分的致病菌之一,且與慢性牙周炎的關(guān)系最為緊密,變形鏈球菌(Streptococcus mutans,SM)則是齲病的主要致病因素[6-8]。固定矯治系統(tǒng)中,釉質(zhì)黏結(jié)劑是一個重要組成部分[9]。隨著口腔材料的發(fā)展,目前臨床常用的釉質(zhì)黏結(jié)劑主要有化學(xué)固化、光固化及含氟光固化三大類。本研究旨在檢測不同組分釉質(zhì)黏結(jié)劑對牙齦卟啉單胞菌和變形鏈球菌增殖的影響,評價并篩選有較強抑菌作用的釉質(zhì)黏結(jié)劑,為臨床釉質(zhì)黏結(jié)劑的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑

標準菌株選用變形鏈球菌菌株SM UA159和牙齦卟啉單胞菌Pg ATCC33277標準菌株,所用菌株均由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔微生物實驗室提供。矯治器選用金屬網(wǎng)底雙翼托槽(新亞,中國)。

黏結(jié)系統(tǒng)分成三組,分別為化學(xué)固化型:UniteTM黏結(jié)樹脂(3M Unitek,加利福尼亞,美國);光固化型:Transbond XT光固化樹脂(3M Unitek,加利福尼亞,美國);含氟光固化型:GC光固化正畸黏結(jié)用水門汀(GC Fuji ORTHO LC,株式會社,東京,日本)。

1.2 人工唾液配制

不含氟人工唾液的配制,每1 000 ml中含KCl 1.3 g,NaCl 0.1 g,MgCl2·6H2O 0.01 g,CaCl2·2H2O 0.03 g,細菌蛋白胨(Bactopeptone)0.5 g,KH2PO40.027 g,K2HPO40.035 g。調(diào)整pH至7.0,高溫高壓滅菌后備用。

1.3 細菌溶液配制

細菌溶液配置,將變形鏈球菌菌株SM UA159和牙齦卟啉單胞菌Pg ATCC33277標準菌株用腦心浸液培養(yǎng)基(Brian Heart Infusion;BHI,Biomerieus Sa公司,法國)在含95%N2和5%CO2的37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中復(fù)蘇及傳代。實驗所用菌液均為傳代2次的新鮮菌液,使用前用紫外分光光度計測定并調(diào)整菌液光密度值,以保證菌液濃度的一致性。

1.4 離體牙制備及托槽黏結(jié)

取離體雙尖牙,雙氧水處理浸泡,去除牙周膜組織,高溫高壓滅菌后備用。

離體牙牙面使用37%的Ultra-Etch(Ultradent product Inc.,猶他州,美國)酸蝕處理,干燥后每組離體牙采用同一種組分釉質(zhì)黏結(jié)劑進行黏結(jié),將金屬網(wǎng)底雙翼托槽黏結(jié)至離體雙尖牙牙冠中心,確保刮除溢出的釉質(zhì)黏結(jié)劑,以模擬臨床使用情況。

1.5 離體牙培養(yǎng)

根據(jù)釉質(zhì)黏結(jié)劑不同(化學(xué)固化組,光固化組及含氟光固化組)分為三組,每組30個樣本。將離體牙黏結(jié)固定矯治器后置入菌液,分別培養(yǎng)1 d、3 d和5 d取出,使用人工唾液漂洗去除沒有黏附在離體牙表面的細菌,然后將每組離體牙放入3 ml生理鹽水的離心管,在漩渦混合器上振蕩60 s,將離體牙表面黏附的菌振蕩下形成含菌懸液備用。

1.6 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測細菌增殖

使用One-tag PCR快速反應(yīng)試劑(M0486L,NEB公司,美國)進行檢測,吸取細菌懸液2 μl加入10 μl的one-tag PCR試劑中,再加入上下游引物各1 μl,加入6 μl無菌水,混勻后放入PCR儀進行目標細菌基因擴增,并于1%瓊脂糖電泳分析表達。將含菌懸液分別進行PCR檢測。分別參照GeneBank中16S rDNA基因序列NR-074234.1和23S rDNA基因序列NR-076188.1,合成檢測Pg菌16SrDNA基因和SM菌23S rDNA基因的引物。Pg菌引物基因:上游(F):5′-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3′,下游(R):5′-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3′。SM菌引物基因:上游(F): 5′-ACGTGCGAGGTTAAGTTGAAG-3′,下游(R),5′-TTGTCTGTGCAACCCCACAT-3′。實驗操作按試劑盒說明進行,取相對數(shù)值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SAS6.0統(tǒng)計軟件進行分析,對三組在不同觀測時間的Pg和SM增殖與培養(yǎng)1 d化學(xué)固化組相應(yīng)細菌增殖對比,取倍率進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用配對t檢驗比較三組組內(nèi)不同時間點與該組1 d時細菌增殖差異;采用t檢驗比較三組組間相同時間點的細菌增殖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組分釉質(zhì)黏結(jié)劑組離體牙表面Pg的增殖結(jié)果

不同組分釉質(zhì)黏結(jié)劑組Pg的PCR結(jié)果見表1。在各組內(nèi)部,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,化學(xué)固化組Pg增殖顯著增加,培養(yǎng)3 d增殖為培養(yǎng)1 d的106%,而培養(yǎng)5 d為培養(yǎng)1 d的116%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(3 d:P<0.05,5 d:P<0.01)。光固化組及含氟光固化組Pg增殖隨培養(yǎng)天數(shù)的增加未見明顯增加,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。光固化及含氟光固化組培養(yǎng)3 d和5 d的Pg增殖與化學(xué)固化組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),光固化組及含氟光固化組各時間段Pg菌含量無顯著差異。

表1牙齦卟啉單胞菌的增殖結(jié)果

Table1TheproliferationofPgafterculturefordifferenttimeineachgroup

組別1d3d 5d 化學(xué)固化組1001±00551063±0023?1158±0001??光固化組0997±00850990±0001##1007±0002##含氟光固化組0961±00230986±0001##1005±0004##

同組與1 d比較,*P<0.05,**P<0.01;同時間與化學(xué)固化組相比,##P<0.01

2.2 不同組分釉質(zhì)黏結(jié)劑組離體牙表面SM的增殖結(jié)果

不同組分釉質(zhì)黏結(jié)劑組SM的PCR結(jié)果見表2。在各組內(nèi)部,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,化學(xué)固化組及光固化組SM菌增殖逐步增加。培養(yǎng)5 d時,化學(xué)固化組和光固化組SM增殖分別為培養(yǎng)1 d時的107.2%和107.8%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(化學(xué)固化組:P<0.05,光固化組:P<0.01)。而含氟光固化組在培養(yǎng)3 d和5 d呈現(xiàn)不同程度的SM增殖下降情況;與培養(yǎng)1 d相比,培養(yǎng)3 d下降27%,培養(yǎng)5 d下降10%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。培養(yǎng)3 d和5 d,光固化組及化學(xué)固化組SM增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義,含氟光固化組較化學(xué)固化組及光固化組SM增殖顯著降低(P<0.01)。

表2變形鏈球菌的增殖結(jié)果

Table2TheproliferationofSMafterculturefordifferenttimeineachgroup

組別1d3d 5d 化學(xué)固化組1000±00350986±0028 1072±0001?光固化組0998±00131039±00011078±0001??含氟光固化組1008±00170732±0000??△△##0907±0000??△△##

與1 d比較,*P<0.05,**P<0.01;同時間與化學(xué)固化組相比,△△P<0.01;同時間與光固化組相比,##P<0.01

3 討論

固定正畸治療中,矯治裝置改變了患者的口腔內(nèi)環(huán)境,口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生很大的變化。托槽的安放,增加了口腔內(nèi)與食物接觸的表面積,表面凹凸不平的設(shè)計使細菌更容易在牙體表面附著并形成菌斑,增加齲病風(fēng)險[2,4,8],菌斑主要分布在牙齦線、托槽和弓絲周圍[10]。托槽黏結(jié)前對牙釉質(zhì)的酸蝕造成的粗糙表面增加了釉質(zhì)白斑的發(fā)生率[11]。弓絲及其他輔助矯治裝置的安放讓口腔清潔的難度劇增,進一步加重齲病風(fēng)險。目前評價患者齲活性的常用指標之一就是測定唾液中的變形鏈球菌濃度,但其受唾液的其他參數(shù),如流速、流量及pH值等的影響較大[12]。本實驗采用PCR技術(shù),以牙菌斑中變形鏈球菌的增殖表達作為測量指標,能更客觀地反映出致齲危險性。

同時,固定正畸治療也會引起牙周組織的反應(yīng),托槽的底部與牙齦邊緣較近,有時甚至緊靠牙齦緣,容易積聚大量的細菌和軟垢,形成牙結(jié)石,進而引發(fā)牙齦或者牙周炎性反應(yīng),例如牙齦組織的增生或萎縮、牙槽骨和牙根的吸收,齦溝液的變化等[3,13,14]。這些牙周組織的反應(yīng)是否是一種長期的、不可逆的損傷,還存在爭論,但是對于口腔衛(wèi)生狀況良好的患者,正畸治療益大于弊,是學(xué)術(shù)界的認識趨勢[15]。牙齦卟啉單胞菌是研究廣泛且證據(jù)充足的重要牙周致病菌之一,是革蘭氏陰性厭氧菌,對標本的輸送時間、條件要求很高。本實驗采用PCR技術(shù),直接檢測牙齦卟啉單胞菌的DNA拷貝數(shù),有較高的精確度,趙煥英等[16]的研究也證實16S rDNA為基因引物的PCR技術(shù)的敏感性及特異性較高。

托槽的底板與牙體組織存在一定的間隙,使用釉質(zhì)黏結(jié)劑一方面將托槽與牙面黏合,另一方面也充填了上述間隙,從而使托槽底板和牙體表面更貼合。本實驗選用了臨床上常用的釉質(zhì)黏接劑,分別是化學(xué)固化、光固化及含氟光固化三種,檢測在釉質(zhì)黏結(jié)劑的影響下牙周炎及齲病特異性菌株的增殖反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),化學(xué)固化組Pg隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加增殖顯著增加,離體牙在菌液中培養(yǎng)3 d與1 d的數(shù)量相比差異明顯,培養(yǎng)5 d后更有顯著增長,說明化學(xué)固化組的釉質(zhì)黏結(jié)劑對Pg的增殖和對牙周炎性反應(yīng)的發(fā)生沒有抑制作用,這與王建寧等[17]的體內(nèi)研究結(jié)果趨勢一致。同時我們發(fā)現(xiàn),光固化組及含氟光固化組Pg隨培養(yǎng)天數(shù)的增加未見明顯增殖,并較同時間點化學(xué)固化組有顯著差異,這說明與化學(xué)固化釉質(zhì)黏結(jié)劑相比,光固化及含氟光固化釉質(zhì)黏結(jié)劑對Pg有一定的抑制能力,對牙周炎性反應(yīng)有一定的抑制作用。Sigusch等[18]和Lee等[19]的體外研究發(fā)現(xiàn)光固化燈的照射可以促進釉質(zhì)黏結(jié)劑的聚合作用,減少殘余單體含量,從而使牙齦成纖維細胞的毒性作用減少。本研究結(jié)果也在一定程度證實了光固化燈對牙周炎性反應(yīng)的抑制作用,同時發(fā)現(xiàn)氟離子的存在可以進一步減少釉質(zhì)黏結(jié)劑對牙周組織的不利影響。

多項研究表明,含氟光固化黏結(jié)劑可以釋放陽離子和氟離子,可以抑制菌斑中致齲菌的聚集,降低致齲風(fēng)險[20-22]。本研究中,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,化學(xué)固化組及光固化組SM增殖逐步增加。而含氟光固化組在培養(yǎng)3 d和5 d呈現(xiàn)不同程度的SM增殖下降情況,并且較化學(xué)固化組及光固化組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這與文獻報道結(jié)果一致[20-22]。含氟光固化組中,培養(yǎng)5 d較3 d SM菌增殖略有上升,這也提示氟離子對SM的抑制作用具有一定時效性,從而進一步提示臨床在正畸治療中,按照特定間隔定期涂氟有助于保持氟離子濃度,從而有助于防齲。

綜上所述,含氟光固化及光固化釉質(zhì)黏結(jié)劑在短期內(nèi)對Pg有一定抑制作用,含氟光固化釉質(zhì)黏結(jié)劑對其的抑制作用更顯著;含氟光固化釉質(zhì)黏結(jié)劑對SM有顯著抑制作用。因此,本研究提示,在固定正畸過程中使用含氟光固化釉質(zhì)黏結(jié)劑有助于減少齲病和牙周炎癥的發(fā)生。

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