半胱胺對局灶性腦缺血大鼠氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡的影響

徐玉振，王 茜，趙大鵬，趙 林，楊海燕，王 濤

（泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院：1神經(jīng)內(nèi)科，2中心實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安271000）

0 引言

局灶性腦缺血可引起缺血區(qū)神經(jīng)損傷，進(jìn)而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)導(dǎo)致幸存患者永久性的神經(jīng)功能障礙。腦卒中是一種急性腦血管疾病，已成為成年人致死和致殘的首要原因。研究［1］發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期繼發(fā)全腦的急性損傷，包括顱內(nèi)壓升高、腦灌注壓下降、微循環(huán)紊亂、腦水腫形成，氧化應(yīng)激和遲發(fā)性腦血管痙攣以及微血管系統(tǒng)損傷等，稱為早期腦損傷。其中，氧化應(yīng)激往往引起血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血腦屏障破壞，縮血管物質(zhì)生成和誘導(dǎo)促細(xì)胞凋亡酶的產(chǎn)生［2］。因此，抗氧化劑曾被用來治療局灶性腦缺血的氧化應(yīng)激，從而減輕腦損傷，改善預(yù)后［3］。

半胱胺是一種安全的抗氧化劑，是輔酶A的降解產(chǎn)物，已被美國食品及藥品管理局批準(zhǔn)用于治療胱氨酸貯積癥。近期研究［4］表明，半胱胺或可用于亨廷頓舞蹈癥和非酒精性脂肪肝病的臨床療效；因其能通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，在治療神經(jīng)變性疾病動物模型中，半胱胺表現(xiàn)出抗氧化作用和神經(jīng)保護(hù)作用［5］，但半胱胺治療局灶性腦缺血的研究較少。我們推測半胱胺對局灶性腦缺血后早期腦損傷的神經(jīng)起保護(hù)作用。本研究探討半胱胺對大鼠局灶性腦缺血后的氧化應(yīng)激和皮層神經(jīng)元凋亡的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑研究采用雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于恒溫24℃±1℃恒濕 （60%±5%環(huán)境鼠籠中，12 h晝夜循環(huán)。半胱胺購自美國Sigma公司，丙二醛試劑盒及還原型谷胱甘肽檢測試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所，兔抗鼠caspase?3抗體、抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 568?結(jié)合山羊抗小鼠抗體購自美國Life technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟與分組實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組（n＝20），MCAO組（n＝20）和半胱胺組（n＝20）。 根據(jù) Longa改良線栓法制備大鼠MCAO模型［6］。簡要說明手術(shù)過程：大鼠腹腔注射水合氯醛（350 mg／kg）麻醉，以電熱板及電燈泡保溫，使動物身體核心溫度不低于37℃。頸部正中皮膚切開，鈍性分離暴露左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和勁外動脈分岔口處，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端及頸總動脈近心端，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，于頸總動脈遠(yuǎn)心端上做一切口，插入預(yù)備的硅膠頭線栓，使其沿著頸總動脈進(jìn)入頸內(nèi)動脈，深度為1.8～2.0 cm到達(dá)大腦中動脈起始部，后固定線栓，檢查無出血后縫合頸部皮膚。假手術(shù)組大鼠10 mL／DL水合氯醛腹腔注射麻醉后，頸部正中皮膚切開，鈍性分離，暴露出左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和勁外動脈分岔口處，后縫合頸部皮膚。半胱胺配制成200 mg／mL無菌生理鹽水濃縮溶液。MCAO造模后，給予大鼠半胱胺（0.1 mL，20 mg／kg／d）或安慰劑（0.1 mL，無菌生理鹽水）腹腔注射，1次／d，1周后處死大鼠。各組大鼠斷頭取腦，冰鹽水沖洗干凈血液及血凝塊，右側(cè)腦組織標(biāo)本用于活性氧族檢測，左側(cè)腦組織迅速用液氮冷凍保存于－80℃，用于生物化學(xué)檢驗(yàn)。

1.3 腦組織氧化應(yīng)激檢測腦勻漿活性氧族（reac?tive oxygen species，ROS）水平通過 DCDHF?DA 方法測定［7］，在 ROS 存在時，DCDHF?DA 在細(xì)胞內(nèi)被氧化并轉(zhuǎn)化成一種熒光復(fù)合物DCF被限制于細(xì)胞內(nèi)。0.45 mL腦勻漿與 5 μL DCDHF?DA 加入 24 孔板37℃ 避光 30 min，然后使用 SpectraMax M5e多模式酶標(biāo)儀 （Molecular Devices，美國）檢 測 DCF。ROS生成通過 DCF標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，數(shù)值表示為pmol／mg／min。腦勻漿氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志物檢測步驟：腦組織樣品勻漿后收集上清液，測定蛋白濃度，使用商業(yè)化試劑盒檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）及還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。

1.4 免疫組織化學(xué)染色大鼠于MCAO造模1周后麻醉并經(jīng)心臟灌注固定。取出腦組織保存于4%多聚甲醛溶液中固定6 h，再浸于30%蔗糖溶液4℃下3 d。腦冰凍切片（層厚 18 μm）磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗 3次，10 mL／DL山羊血清封閉，PBS沖洗，0.1 mL／DL Triton X?100 室溫 2 h，切片與 caspase?3抗體（1 ∶100）4℃共同孵育12 h，二抗孵育1 h。 孵育完成后，切片滴加抗淬滅溶液后加蓋玻片保存。將載玻片置于共聚焦顯微鏡（Nikon，日本）下觀察，采用恒定參數(shù)采集圖像。從腦皮質(zhì)切片的3個顯微鏡視野（20×）中選擇活化caspase?3陽性的細(xì)胞采集圖像［8］。 計(jì)數(shù) caspase?3陽性細(xì)胞，取 3 幅圖像的平均數(shù)。

1.5 Tunel染色模型大鼠以10% 水合氯醛深度麻醉，經(jīng)心臟以0.9%氯化鈉灌洗，處死大鼠，留取腦組織制作冰凍切片。每隔100 μm取1張切片，共取3張，復(fù)溫后用冰丙酮固定15 min，PBS洗滌10 min×3遍，后用5%山羊血清室溫封閉1 h。Tunel染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。Tunel工作液中加入Dylight.羊抗兔 IgG 熒光二抗（1 ∶300），室溫孵育1 h，后PBS避光洗滌5 min×3遍，抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下拍照［9］。每張切片隨機(jī)選取3個視野，運(yùn)用Image ProPlus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one?way ANOVA）。數(shù)據(jù)使用±s表示。多個組間比較先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者再行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 半胱胺對局灶性腦缺血后MDA及GSH表達(dá)的影響與對照組相比，MCAO組和Cysteamine組大鼠腦組織的 MDA表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與MCAO組相比，Cysteamine組大鼠腦組織的MDA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05，圖 1）。

與對照組相比，MCAO組和Cysteamine組大鼠腦組織的GSH表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與MCAO組相比，Cysteamine組大鼠腦組織的GSH表達(dá)量明顯升高（P＜0.05，圖 1）。

圖1 半胱胺對局灶性腦缺血后MDA及GSH表達(dá)的影響

2.2 半胱胺抑制局灶性腦缺血后神經(jīng)元凋亡半胱胺對局灶性腦缺血后caspase?3表達(dá)的影響及腦組織Tunel染色（圖 2）。與對照組相比，MCAO組和Cysteamine組大鼠腦組織的 caspase?3的表達(dá)量及Tunel陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與MCAO組相比，Cysteamine組大鼠腦組織的caspase?3的表達(dá)量及Tunel陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織caspase?3的表達(dá)及Tunel染色

3 討論

本研究顯示，腹腔內(nèi)注射半胱胺（20 mg／kg／d），能夠顯著抑制局灶性腦缺血大鼠的氧化應(yīng)激以及神經(jīng)元的凋亡。半胱胺治療可顯著抑制局灶性腦缺血誘導(dǎo)的MDA生成，上調(diào)GSH的表達(dá)，同時減少凋亡蛋白caspase?3的表達(dá)及Tunel陽性細(xì)胞數(shù)。這些發(fā)現(xiàn)提示半胱胺對局灶性腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能是治療局灶性腦缺血神經(jīng)損傷的有效方法。

氧化應(yīng)激介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化主要發(fā)生在內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元，可導(dǎo)致細(xì)胞的功能障礙和凋亡，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與血腦屏障破壞和腦水腫相關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與神經(jīng)功能缺失的發(fā)生有關(guān)［10］。 Shin 等［11］的研究表明，過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，半胱胺可降低氧化應(yīng)激水平從而阻止細(xì)胞凋亡；Okamura等［12］的研究表明，半胱胺可通過降低氧化應(yīng)激水平改善慢性腎病的纖維化改變。上述研究與本研究結(jié)果一致，但均未涉及神經(jīng)系統(tǒng)。在本研究中，半胱胺治療改善了局灶性腦缺血大鼠的氧化應(yīng)激，降低了神經(jīng)元的凋亡水平，說明抗氧化應(yīng)激是半胱胺在局灶性腦缺血后發(fā)揮保護(hù)作用的潛在機(jī)制之一。

細(xì)胞凋亡發(fā)生于局灶性腦缺血后的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在早期腦損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。Besouw等［14］的研究表明，半胱胺治療可阻止真皮細(xì)胞的凋亡。而本研究結(jié)果顯示，半胱胺能夠降低大鼠局灶性腦缺血后caspase?3水平的升高，半胱胺抗凋亡的作用在Tunel實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)。本研究結(jié)果證實(shí)了在神經(jīng)系統(tǒng)中半胱胺的抗凋亡作用，這與前人的結(jié)果一致［15］。以上發(fā)現(xiàn)提示抗凋亡作用也是半胱胺在局灶性腦缺血腦損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用的潛在機(jī)制之一。

半胱胺的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制復(fù)雜。Besouw等［16］指出，半胱胺能夠在胱氨酸病中耗竭溶酶體的胱氨酸，升高細(xì)胞的谷胱甘肽水平，通過交聯(lián)到硫醇組中改變酶活性，并能調(diào)控多個基因表達(dá)，尚待進(jìn)一步研究。 綜上所述，腹腔內(nèi)注射半胱胺（20 mg／kg／d）能夠抑制氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡，從而對大鼠局灶性腦缺血誘導(dǎo)的早期腦損傷提供保護(hù)作用。

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