植物花青素生物合成途徑相關(guān)基因的研究進展

張云潔 潘怡辰 王汝茜 李集臨 張杰

摘要

花青素是自然界中存在的天然色素。通過基因工程等技術(shù)手段可以生產(chǎn)出綠色、健康的保健品、水果及觀賞性花卉植物。目前與花青素生物合成相關(guān)的基因已通過PCR、蛋白質(zhì)純化、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等技術(shù)手段從金魚草、玉米、矮牽牛等植物中分離且克隆。本研究綜述了花青素合成途徑相關(guān)調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因的研究進展。

關(guān)鍵詞 花青素;調(diào)節(jié)基因;結(jié)構(gòu)基因

中圖分類號 S188+.1 ?文獻標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12014-03

Research Progress of Genes which Relate to the Biosynthetic Pathway of Anthocyanins

ZHANG Yunjie， PAN Yichen， WANG Ruxi， ZHANG Jie* et al

（Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150025）

Abstract Anthocyanins are natural pigments， green health care products， fruit and ornamental flowering plants can be produced by such means as genetic engineering technology. Currently， the genes relate to anthocyanins biosynthesis have successfully been isolated and cloned from Antirrhinum majus， Zea mays， Petunia hybrida and other plants through as PCR， protein purification， transposon tagging， etc. Anthocyanin biosynthesisrelated adjustment advances in genetic and structural genes were reviewed.

Key words Anthocyanins; Regulation gene; Structural gene

基金項目 哈師大博士科研啟動基金項目（08XBSK87）。

作者簡介

張云潔（1988-），女，黑龍江虎林人，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)。*通訊作者，教授，博士，從事活性蛋白多肽組學(xué)研究及分子遺傳學(xué)方面的研究。

收稿日期 20141027

花青素是植物類黃酮次生代謝途徑的產(chǎn)物，是一種天然水溶性色素，以花色苷的形式存在。它使花、果實、種子、根等器官呈紅色、藍(lán)色、紫色、藍(lán)紫色等[1]?；ㄇ嗨鼐哂袕V泛的功能，如吸引昆蟲進行花粉傳播、防止紫外線損傷、預(yù)防病原體攻擊、抗寒抗旱等。近期研究表明，花青素有益于人類健康，包括防止癌癥、炎癥、冠狀動脈心臟疾病和其他潛在的與年齡有關(guān)的疾病[2]。因此，對于花青素的轉(zhuǎn)錄合成途徑及其代謝調(diào)控的研究具有重要的意義。

1 ?植物中花青素的合成途徑

花青素是類黃酮途徑代謝產(chǎn)物，在自然條件下通常與一個或多個鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖等通過糖苷鍵結(jié)合，很少以游離狀態(tài)存在，一般不影響花色素的呈色反應(yīng)。

目前，類黃酮途徑在擬南芥、矮牽牛、玉米等植物中已較清楚。合成前體是苯丙氨酸，可分為4個階段。苯丙烷途徑是

第一個途徑，是大部分次生代謝產(chǎn)物所共有的途徑，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）調(diào)控使其脫去氨基，形成反式肉桂酸[3]，再經(jīng)肉桂酸4羥化酶（C4H）的作用形成反式4香豆酸。在香豆酸輔酶A連接酶催化下形成香豆酸輔酶A?；罨a(chǎn)生的香豆酸可以進一步形成肉桂酸進入木質(zhì)素途徑[4]。第2個階段由香豆酸與丙二酰輔酶A在查爾酮合酶（CHS）的作用下催化合成4羥基查爾酮，再經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶（CHI）的催化下形成柚皮素，然后在黃烷酮3羥化酶（F3H）催化下形成二氫黃酮醇。這一階段出現(xiàn)了如黃酮醇、原花青素苷、異黃酮、鞣紅等多個重要的分支途徑[4]。第3個階段在二氫黃銅醇4還原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和無色花青素雙加氧酶（LDOX）的催化下形成各種花青素[5]。第4階段形成的花青素經(jīng)過一系列糖基化、?；?、甲基化的修飾形成穩(wěn)定的花青素苷，通過轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)揭号葜懈患蛢Υ鎇6]（圖1）。

2 ?花青素合成途徑的調(diào)控基因

目前研究證實，影響花青素合成的調(diào)節(jié)基因有MYB、MYC（bHLH）、WD40、WRKY、鋅脂蛋白、同源域蛋白、MADS蛋白基因家族，其中與花青素合成有直接關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白3種[7]。這些轉(zhuǎn)錄因子與真核基因的順式作用元件特異性結(jié)合，激活或抑制花青素合成途徑中多個基因的表達，從而調(diào)控花青素的生物合成途徑。

植物中的MYB蛋白屬于DNA結(jié)合蛋白，含有一段保守的結(jié)合區(qū)域，即MYB結(jié)構(gòu)域。目前，已從玉米、金魚草、水稻、矮牽牛、葡萄、擬南芥、非洲菊、蘋果、番薯、石竹目、草莓、小麥等中克隆鑒定出[8]。一般每個MYB區(qū)域含有51～53個氨基酸，每個MYB區(qū)折疊成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的形式與DNA的大溝結(jié)合。植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子可根據(jù)所含有的MYB結(jié)構(gòu)域數(shù)目分為3種。一類是只含有一個MYB結(jié)構(gòu)的MYB蛋白。研究表明，它是一類重要的端粒結(jié)合蛋白，對于維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、完整及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有重要作用。第2類是含有2個MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子。它們參與植物次生代謝、細(xì)胞分化、抗逆脅迫、激素應(yīng)答等多方面的調(diào)控。第3類是含有3個結(jié)構(gòu)域的R1R2R3MYB，與真菌和動物中的MYB蛋白高度同源，參與細(xì)胞分化和細(xì)胞周期的調(diào)控[9]。

另一類轉(zhuǎn)錄因子是bHLH蛋白，廣泛地存在于各種生物中，從簡單的酵母菌到復(fù)雜的多細(xì)胞生物，如人類。研究表明，bHLH蛋白參與調(diào)控多數(shù)物種的細(xì)胞增殖作用及多個分化途徑。在植物中bHLH蛋白具有廣泛的功能，如參與調(diào)控表皮細(xì)胞的分化、花器官的發(fā)育調(diào)節(jié)、激素應(yīng)答、類黃酮生物合成等[10]。在擬南芥中已分離、鑒定出133個bHLH基因，最初被劃分為12個亞類[11]。進一步研究從擬南芥、楊樹、苔蘚及藻類中分離了638個bHLH基因家族，使原來的系統(tǒng)進化樹延伸為32個亞類[12]。

目前WD40蛋白在許多真核細(xì)胞生命進程中被看作為重要的調(diào)節(jié)因子，包括細(xì)胞分裂、囊泡的形成和轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA加工修飾。這些蛋白質(zhì)通常由44～60個氨基酸組成的肽基序，通常由GH二肽（甘氨酸-色氨酸）在N末端和WD二肽（色氨酸-天冬氨酸）在C末端[13]。值得注意的是，WD40通過參與組蛋白修飾的染色質(zhì)構(gòu)型重塑，影響轉(zhuǎn)錄過程[14]。MYB和bHLH結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用已被廣泛研究，一直是最近10年研究的焦點，特別是類黃酮生物合成途徑[15]。WD40蛋白被認(rèn)為不具有任何催化活性，而似乎是一個對接平臺在調(diào)節(jié)花青素和PA的生物合成途徑。例如，在擬南芥中，TTG1主要通過與 bHLH合作調(diào)控TT2TT8TTG1的表達[16]。

圖1 花青素、黃酮醇和原花青素等類黃酮物質(zhì)生物合成途徑[4]

3 ?花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因

在花青素生物合成中主要的酶基因有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）、二羥基黃酮醇還原酶（Dihydroflavonol 4reductase，DFR）、黃烷酮3羥化酶（Flavanone 3hydroxylase，F(xiàn)3H）、花色素苷合成酶（Anthocyanin synthase，ANS） 以及類黃酮3O糖基轉(zhuǎn)移酶（ flavonoid 3Oglucosyltransferase，UFGT）。目前，通過PCR、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法及蛋白質(zhì)純化等方法已從玉米、矮牽牛、蘋果、金魚草、草莓等植物中分離、克隆出花青素合成相關(guān)酶基因。

苯丙氨酸解氨酶催化L苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是植物花青素類黃酮合成途徑中的第一個酶。它存在于所有綠色植物中，在藻類、真菌、細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)。研究表明，不同植物中PAL活性不同。在一株植物中，不同的組織部位活性也不同，一般越嫩的部位PAL活性越高。PAL基因由4個亞基組成，有多個基因家族編碼，在這個家族中不同成員的表達具有特異性[17]。目前，已從多數(shù)植物組織中分離、純化出PAL，不同來源的PAL結(jié)構(gòu)、分子量等均不相同，但總體來說分子量為240～330 kD，一般可解離成55～85 kD的亞基。苯丙氨酸解氨酶是由4個相同亞基構(gòu)成的四聚體。PAL沒有固定的Km值，一般在10-2～10-4之間，其活性中心部位含有脫氫丙氨酰基的親電中心[18]。

查爾酮合酶基因目前已從多數(shù)植物中克隆得到，如擬南芥、苜蓿、水稻、小麥、玉米等[19]。研究表明，CHS在多數(shù)植物中存在多個拷貝，尤其是在雙子葉植物中，如大豆、矮牽牛等;但是在小麥、玉米、大麥等單子葉植物中一般只含有2個CHS基因。除金魚草外，CHS在不同植物中的保守性較高，一般含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，其中外顯子1編碼約60個左右的氨基酸殘基，而外顯子2編碼約340個左右氨基酸殘基，內(nèi)含子的差異相對較大[20]。

查爾酮異構(gòu)酶基因最早是通過抗體技術(shù)從法國豌豆中分離出來的[21]，之后陸續(xù)從矮牽牛、玉米、豌豆、苜蓿、翠菊和水蓮等植物中分離克隆出。CHI按作用底物不同可以分為兩類，一類存在于豆科植物中，另一類存在于非豆科植物中。還有研究表明，CHI除在植物中普遍存在外，在真菌、黏土霉菌中都存在植物CHI直系同源類的蛋白，但是缺乏上游的查爾酮合酶（CHS）。研究表明，CHI基因結(jié)構(gòu)上變化很大，不同類型的CHI基因即使在同一物種中差異也比較大，同源性一般為42%～65%[22]。

二羥基黃酮醇4還原酶（DFR）是催化二氫櫟皮黃酮（DHQ）生成無色花青素、二氫楊梅黃酮（DHM）生成無色花翠素、二氫堪非醇（DHK）生成無色花葵素的關(guān)鍵酶[5]。DFR基因最早從玉米、矮牽牛和金魚草中分離出來，后續(xù)從擬南芥、水稻、馬鈴薯、蘋果、小麥等中克隆出來[23]。在不同的物種中，DFR氨基酸序列有較高的同源性，與NADPH的結(jié)合位點也是保守的。不同物種的DFR基因在不同的部位和不同的發(fā)育期的表達特性也存在差異[5]。

黃烷酮3羥化酶是植物類黃酮類化合物代謝途徑的關(guān)鍵酶，是依賴型2酮戊二酸的雙加氧酶（2ODD）的家族成員，需要抗壞血酸、分子氧、2酮戊二酸和鐵參與代謝反應(yīng)，催化柚皮素C3位羥基化，生成二氫山奈素（DHK）[5]。DHK則是異黃酮、黃銅合成的重要代謝中間產(chǎn)物。F3H基因最早從金魚草中被克隆分離出，已在許多植物中被分離克隆到，如銀杏、蘋果、小麥、紫花苜蓿和玉米等。鑒于柚皮素作為F3H的作用底物，F(xiàn)3H參與黃酮和花青素苷產(chǎn)物合成的調(diào)控，是整個黃酮類化合物代謝途徑的關(guān)鍵位點[24]。

花青素合成酶基因最早是從玉米突變體中利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離得到的。研究表明，ANS蛋白屬于2酮戊二酸雙加氧酶家族，與類黃酮合成途徑中其他同屬此家族的黃酮醇合成酶具有保守的同源關(guān)系[25]。

類黃酮3O糖基轉(zhuǎn)移酶和花青素合成酶都是花青素苷生物合成途徑后期起關(guān)鍵作用的酶，通過與液泡、細(xì)胞質(zhì)的共同作用使花青素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定狀態(tài)的花色苷。UFGT基因目前在紫蘇、花生、馬鞭草等植物中已有所報道。研究表明，在蘋果、草莓和荔枝中花青素苷積累與UFGT活性呈明顯的正相關(guān)[26]。

4 ?展望

近些年對有關(guān)花青素生物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的研究取得很大的進步，如合成后期酶的修飾、運輸、沉積等方面的研究都為進一步揭示花青素生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。分子生物學(xué)、酶工程的發(fā)展及基因工程的應(yīng)用可以進一步分離、鑒定出轉(zhuǎn)錄因子，有效地調(diào)控植物花色素的積累，開發(fā)出有益于人類健康的富含花青素的保健品。

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