基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移熒光傳感器檢測土壤中的Hg2+

劉 萍， 王書民， 任有良， 任夢萌

(1.商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院，陜西商洛 726000；2.陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西商洛 726000)

汞是一種毒性很強(qiáng)的環(huán)境污染物，具有致畸作用，有生物不可降解性[1]。因此，建立一種簡單、快速、選擇性好、靈敏度高的檢測Hg2+的方法非常重要。常用檢測Hg2+的方法主要有原子吸收法[2]、電化學(xué)法[3]、 化學(xué)發(fā)光法[4]、熒光法[5 - 7]、高效液相色譜法[8]及電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9]等。胸腺嘧啶(T) 與 Hg2+能夠特異性結(jié)合形成“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)，利用富含T堿基的短鏈 DNA 實(shí)現(xiàn) Hg2+特異性檢測的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)。如高強(qiáng)課題組[10]利用溴化乙錠為嵌入劑，設(shè)計(jì)了一種無需對DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記的Hg2+熒光傳感器。Ono等[11]利用分子信標(biāo)的原理，設(shè)計(jì)了一種猝滅型的Hg2+熒光傳感器。加入Hg2+后，T-Hg2+-T介導(dǎo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成，將相應(yīng)熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)拉近，二者之間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光信號猝滅，從而實(shí)現(xiàn)Hg2+的檢測。鄧大慶等[12]利用Pb2+和Hg2+與凝血酶適配體作用引起其構(gòu)型變化的不同，建立了分別檢測Pb2+和Hg2+的熒光傳感器。傳統(tǒng)的熒光傳感器熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)大都是有機(jī)染料分子，有的還用納米材料作為熒光猝滅劑。但是，基于納米材料的檢測方法往往實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣且耗時(shí)[13]。因此，尋找其他的猝滅劑，發(fā)展更簡單且靈敏的熒光傳感器是十分必要的。G堿基對熒光染料具有猝滅效應(yīng)，常被用來構(gòu)建熒光傳感器[14 - 15]。

本研究基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)效應(yīng)，利用T與Hg2+形成“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，以末端標(biāo)記羧基熒光素的凝血酶適配體為信號探針，末端上含三個(gè)G堿基互補(bǔ)序列作為猝滅基團(tuán)，根據(jù)加入Hg2+前后體系熒光強(qiáng)度的變化，建立了一種簡單、靈敏的熒光傳感器用于土壤中Hg2+的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；Agilent 5100 ICP-OES(澳大利亞，安捷倫公司)；pHS-3B型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；T-214型電子天平(北京丹佛儀器有限公司)；TGL-18C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

羧基熒光素標(biāo)記的凝血酶適配體(F-TBA)序列:5′-FAM-GGT TGG TGT GGT TGG-3′；cDNA1序列:3′-GGG CCA ACC ACA CCA ACC-5′；cDNA2序列:3′-GGG CCA ACC ACA CCA ACC-5′；cDNA3序列:3′-GGG CCA ACC ACA C-5′；cDNA4序列:3′-GGG CCA ACC AC-5′；cDNA5序列:3′-GGG CCA ACC-5′， 均購自上海生物工程有限公司,使用前均用10 mmol/L的Tris-HAc緩沖溶液(pH=7.4，含0.1 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L MgCl2)配制成100 μmol/L DNA儲備液，并于-20 ℃冷凍保存。其它化學(xué)試劑均為分析純。所用溶液均用 Milli-Q水(18.2 MΩ·cm)配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 方法原理及可行性分析

基于脫氧鳥苷G堿基的猝滅，本文設(shè)計(jì)了一種靈敏且簡便的熒光傳感器用于Hg2+的檢測。無Hg2+時(shí)，F(xiàn)-TBA與cDNA雜交形成雙鏈，cDNA末端富含的G堿基與熒光染料靠近，F(xiàn)AM和G堿基之間發(fā)生PET過程，F(xiàn)AM的熒光被G堿基猝滅。當(dāng)Hg2+存在時(shí)，凝血酶適配體富含的T堿基與Hg2+特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)，凝血酶適配體折疊形成類似雙鏈的結(jié)構(gòu)，釋放出互補(bǔ)鏈，熒光染料遠(yuǎn)離G堿基，體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。通過測定加入不同濃度Hg2+后體系熒光信號的變化，對環(huán)境土壤中的Hg2+進(jìn)行定量分析。Hg2+測定的實(shí)驗(yàn)原理見圖1。

圖1 基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移檢測Hg2+的熒光傳感器實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.1 Schematic illustration of Hg2+ detection based on the photoinduced electron transfer

為了驗(yàn)證該方案的可行性，實(shí)驗(yàn)分別對F-TBA、F-TBA/cDNA、F-TBA/cDNA+Hg2+的熒光光譜進(jìn)行了掃描，結(jié)果如圖2所示。圖中曲線a表示F-TBA的熒光光譜，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，加入互補(bǔ)序列cDNA后，體系的熒光強(qiáng)度明顯降低(曲線b)，說明兩條DNA鏈已經(jīng)雜交，F(xiàn)AM與G堿基間發(fā)生了高效的PET過程，熒光猝滅。加入不同濃度的Hg2+后，體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，熒光恢復(fù)，且加入較大濃度Hg2+時(shí)，熒光恢復(fù)較多(曲線c和d)。表明加入Hg2+后形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)使F-TBA折疊成雙鏈而遠(yuǎn)離cDNA，PET效率降低，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。

為了考察F-TBA/cDNA體系熒光信號的升高是由于Hg2+所致，實(shí)驗(yàn)考察了加入不同濃度Hg2+對F-TBA熒光信號的影響(圖3)。結(jié)果Hg2+加入后F-TBA的熒光信號有所降低，且Hg2+的濃度越大，F(xiàn)AM熒光信號降低的程度越大。但在F-TBA/cDNA體系中加入Hg2+后熒光強(qiáng)度不但沒有降低，反而增強(qiáng)。進(jìn)一步表明該體系熒光增強(qiáng)原因可能是加入的Hg2+與T堿基特異性結(jié)合，TBA形成類似雙鏈的“T-Hg2+-T”發(fā)夾結(jié)構(gòu)，釋放出互補(bǔ)鏈PET效率降低，熒光信號增強(qiáng)。

圖2 F-TBA/cDNA體系與不同濃度Hg2+作用的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of F-TBA/cDNA and Hg2+with different concentrations(a)5 μmol/L F-TBA;(b) a+10 μmol/L cDNA;(c)b+0.05 nmol/L Hg2+;(d) b+5 nmol/L Hg2+.

圖3 F-TBA與不同濃度Hg2+作用的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of F-TBA and Hg2+with different concentrations(a) 5 μmol/L F-TBA;(b-f ):a+0.01,0.1,1,10,100 nmol/L Hg2+.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖4 cDNA和F-TBA不同濃度比的熒光變化圖Fig.4 Fluorescence variation of cDNA and F-TBA with different concentration ratio

2.2.1不同長度互補(bǔ)序列cDNA的選擇考慮到不同堿基個(gè)數(shù)的互補(bǔ)序列與TBA雜交形成雙鏈的穩(wěn)定性對Hg2+檢測有影響，實(shí)驗(yàn)選擇了5個(gè)不同長度的cDNA,堿基互補(bǔ)數(shù)分別為15、12、10、8、6。結(jié)果顯示，所有互補(bǔ)序列都能夠有效猝滅FAM的熒光。當(dāng)加入Hg2+后，堿基互補(bǔ)數(shù)為10的cDNA3熒光增強(qiáng)最多。原因可能是互補(bǔ)鏈越長，形成相對較穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，加入Hg2+后難以使雙鏈解旋，加入Hg2+后適配體上FAM的熒光恢復(fù)較少。堿基數(shù)較少，形成的雙鏈不穩(wěn)定，加入Hg2+前背景熒光很高，加入Hg2+后適配體上FAM的熒光恢復(fù)也較少。選擇cDNA3做互補(bǔ)序列比較合適。

2.2.2F-TBA與cDNA濃度比的選擇F-TBA與cDNA的濃度比不同影響體系的背景信號，進(jìn)而影響Hg2+的檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度比的 F-TBA與cDNA體系加入 5 nmol/L Hg2+后體系熒光強(qiáng)度的變化。固定F-TBA 探針的濃度為 5 μmol/L，改變 cDNA的濃度，結(jié)果顯示cDNA/F-TBA濃度比為1.5∶1時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)最大，見圖4。

2.2.3穩(wěn)定時(shí)間的選擇考察了Hg2+加入F-TBA/cDNA體系充分作用的穩(wěn)定時(shí)間。結(jié)果表明在反應(yīng)初期，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度不斷增加，當(dāng)反應(yīng)到10 min時(shí)體系熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，10 min后熒光強(qiáng)度稍有下降，且逐漸趨于平緩，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇混合10 min后測定。

2.3 檢測范圍和靈敏度

向F-TBA/cDNA體系中加入Hg2+前后，體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，通過熒光強(qiáng)度改變的量實(shí)現(xiàn)對Hg2+的定量檢測。結(jié)果顯示F-TBA/cDNA體系的熒光強(qiáng)度隨Hg2+濃度的增大而升高(圖5(A))，Hg2+的濃度在5.0×10-11～5.0×10-9mol/L范圍內(nèi)與體系熒光強(qiáng)度的變化值ΔF成良好的線性關(guān)系(圖5(B))，線性方程為：ΔF=69.4c+196(c，nmol/L)，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9985，方法的檢出限達(dá)0.02 nmol/L。

圖5 (A)加入不同濃度Hg2+后體系的熒光光譜圖；(B)熒光強(qiáng)度變化率與不同濃度Hg2+的關(guān)系Fig.5 (A)Fluorescence spectra of the systems in the presence of different concentration of Hg2+(a:5 μmol/L F-TBA;b:a+7.5 μmol/L cDNA;Hg2+:c - k:0.05,0.25,0.5,2.5,5,50,500,1 000,2 000 nmol/L);(B) Relationship between the changes of fluorescence intensity and different concentration of Hg2+

2.4 共存離子的干擾實(shí)驗(yàn)

優(yōu)化的條件下，考察了50 nmol/L Co2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Al3+、Cd2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+、K+和 0.5 nmol/L Pb2+對Hg2+檢測的影響。結(jié)果顯示，加入Co2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Al3+、Cd2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+、K+后體系熒光信號變化值ΔF較低，基本上不影響Hg2+的響應(yīng)，只有加入Hg2+和Pb2+時(shí)體系熒光響應(yīng)值高，原因可能是F-TBA富含G堿基，Pb2+加入到F-TBA/cDNA體系會誘導(dǎo)F-TBA 形成穩(wěn)定的G -四鏈體結(jié)構(gòu)釋放出互補(bǔ)鏈引起PET效率顯著降低，熒光信號增強(qiáng)。加入檸檬酸做掩蔽劑后[16]，基本對Hg2+檢測無明顯干擾。表明本方法對Hg2+具有良好的選擇性。

阿東開始教阿里開電腦。教了很多天，阿里終于學(xué)會了。他會打開電腦，也會點(diǎn)開短片。然后坐在電腦前一遍一遍地看媽媽的照片，一邊看一邊笑。

2.5 土壤中Hg2+的測定

為了考察本方法的可行性，用設(shè)計(jì)的傳感器檢測了距離商海市商州區(qū)金尾礦庫20米處農(nóng)田土壤中的Hg2+。準(zhǔn)確稱取1.000 g土壤樣品，加入15 mL濃HNO3、3 mL HClO4混合均勻后靜置過夜，再加入2 mL 濃HCl，置于80 ℃烘箱中加熱，當(dāng)溶液蒸發(fā)至澄清的淺黃色并且微沸冒白煙時(shí)，冷卻至室溫，并用0.1%的HNO3洗滌過濾，最后用水定容至100 mL，然后將該溶液稀釋100倍作為待測液，加入檸檬酸消除Pb2+的干擾。按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)相比較，兩種方法所得結(jié)果基本一致。

表1 土壤樣品中Hg2+的分析結(jié)果(n=3)Table 1 Determination results of Hg2+in the soils(n=3)

3 結(jié)論

本文基于鳥嘌呤G對熒光染料的猝滅作用，構(gòu)建了一種熒光傳感器，根據(jù)向F-TBA/cDNA體系中加入Hg2+前后，體系熒光信號的變化對土壤樣品中Hg2+進(jìn)行定性、定量分析。本方法只需對凝血酶適體進(jìn)行單標(biāo)記，無需引入其他有機(jī)染料或納米材料做猝滅劑，減少了實(shí)驗(yàn)成本，加快了檢測過程。傳感器的建立對環(huán)境污染中的重金屬檢測有很好實(shí)際意義，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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