氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定油脂類食品中氯丙醇酯

曹艷平*， 張 萍， 姜大峰

(山東省疾病預(yù)防控制中心，山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250014)

氯丙醇是在食品加工過(guò)程中形成的污染物,其中3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)具有腎臟毒性、生殖毒性和較高的潛在致癌性。脂肪酸氯丙醇酯是氯丙醇上的羥基與脂肪酸結(jié)合態(tài)形式，在食用油和含油脂類食品中的污染水平較高。3-MCPD可與多種脂肪酸結(jié)合形成多種脂肪酸酯，根據(jù)羥基被取代的個(gè)數(shù)分為單酯和雙酯，導(dǎo)致3-MCPD酯單體較多。二氯丙醇也可與多種脂肪酸結(jié)合形成多種脂肪酸單酯，有1,3-二氯丙醇(1,3-DCP)酯和2,3-二氯丙醇(2,3-DCP)酯。受到標(biāo)準(zhǔn)品的限制，一般是將氯丙醇酯水解后，間接測(cè)定其游離態(tài)3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的含量，可分別體現(xiàn)其相應(yīng)氯丙醇酯的總量。

氯丙醇酯的測(cè)定主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[1 - 4]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[5 - 7]。由于氯丙醇及其酯的沸點(diǎn)高，故基本上以檢測(cè)衍生化產(chǎn)物為主。常用衍生劑主要有七氟丁?；溥?HFBI)、三氟乙酐、對(duì)甲基苯磺酸的丙酮溶液等。樣品中氯丙醇酯經(jīng)堿或酸水解后，氯丙醇酯被水解為游離態(tài)的氯丙醇，水解液經(jīng)酸或堿中和后進(jìn)行衍生，衍生液進(jìn)行GC-MS分析，以游離態(tài)的氯丙醇表示其對(duì)應(yīng)的氯丙醇酯的含量。LC-MS可以直接測(cè)定各種單體的氯丙醇脂肪酸酯，定量取決于購(gòu)買到的氯丙醇脂肪酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)目種類。

本文參考我國(guó)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)方法中氯丙醇酯測(cè)定前處理部分，測(cè)定方法采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)。建立的方法可測(cè)定4大類氯丙醇酯：3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯和2,3-DCP酯。由于二氯丙醇酯的標(biāo)準(zhǔn)品目前無(wú)法購(gòu)買到，分別以其游離態(tài)1，3-二氯-2-丙醇、2，3-二氯-1-丙醇替代，其相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)同樣以D5-1,3-二氯-2-丙醇和D5-2,3-二氯-1-丙醇替代。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

TSQ8000-1310GC氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó),Thermo Fisher公司)；460/H超聲波清洗器(德國(guó),Elma)；B-811自動(dòng)索氏提取器(BüCHI)；N-EVAP112氮吹儀(美國(guó),Organmation Associates)；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BüCHI)；恒溫干燥箱(50 L,MMM)。

標(biāo)準(zhǔn)品：3-MCPD棕櫚酸二酯(98%)、2-MCPD硬脂酸二酯(98%)、氘代同位素內(nèi)標(biāo)D5-3-MCPD棕櫚酸二酯(同位素純度98.1%)和D5-2-MCPD硬脂酸二酯(同位素純度98%)。雙氯取代氯丙醇：1,3-二氯-2-丙醇(99%)；2,3-二氯-1-丙醇(97%)；D5-1,3-二氯-2-丙醇(同位素純度98.9%)和D5-2,3-二氯-1-丙醇(同位素純度98%)，均購(gòu)自Toronto Research Chemicals Inc。甲醇、乙酸乙酯、無(wú)水乙醚、甲基叔丁基醚(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司);正己烷(色譜純，Merck公司);無(wú)水Na2SO4(分析純)：550 ℃ 烘烤4 h,待用;甲醇鈉、冰乙酸(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))；七氟丁?；溥?酰化劑，TCI公司)。 硅藻土基質(zhì)分散固相萃取柱(2 000 mg/45mL)(配專用分散劑(3 g/袋)和高效脫水劑(15 g/袋)，福州勤鵬生物科技公司)。 甲醇鈉溶液：稱取2.70 g甲醇鈉，加入50 mL甲醇，溶解后，裝入塑料瓶冷藏，備用?；旌弦篈：吸取80 mL甲基叔丁基醚和20 mL乙酸乙酯，充分混勻，于玻璃瓶中存放，冷藏，備用?；旌弦築：移取2.0 mL冰乙酸，加入25 mL飽和Na2SO4溶液混勻備用。分別準(zhǔn)確稱取適量(精確到0.01 mg)3-MCPD棕櫚酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-1-丙醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯-正己烷(1:1)溶解,定容,逐級(jí)稀釋配制成4種氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。其中1,3-DCP、2,3-DCP 濃度均為1.4 μg/mL，3-MCPD、2-MCPD濃度均為1.0 μg/mL；4種氘代內(nèi)標(biāo)也配制成混合內(nèi)標(biāo)使用溶液，其中D5-1,3-DCP與D5-2.3-DCP濃度均為2.0 μg/mL，D5-3-MCPD、D5-2-MCPD濃度均為1.5 μg/mL(均以其游離態(tài)3-MCPD、2-MCPD、D5-3-MCPD、D5-2-MCPD表示)。

1.2 樣品中脂肪的提取

將樣品粉碎后，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[8 - 10]進(jìn)行食品中脂肪的提取。油脂類樣品可直接取樣進(jìn)行前處理。

1.3 樣品的前處理

稱取樣品0.1 g(精確至0.001 g),加入0.5 mL混合液A,加混合內(nèi)標(biāo)使用液100 μL，用1.0 mL甲醇鈉水解后，加入0.5 mL混合液B。將基質(zhì)分散固相萃取柱配備的專用硅藻土填料倒入上述中和后的水解液中，使溶液分散、吸附于硅藻土中，將此混合物全部倒入硅藻土基質(zhì)固相分散萃取柱中，用30 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液。用80 mL重蒸無(wú)水乙醚洗脫，收集洗脫液，充分脫水后，洗脫液濃縮至約0.5 mL，用微量取樣器加入50 μL七氟丁?；溥?，于溫度75 ℃的電熱恒溫箱中放置30 min。衍生結(jié)束后，加入2 mL飽和Na2SO4溶液，補(bǔ)加異辛烷體積為1.0 mL，上清液脫水后，供GC-MS/MS測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜條件：TG -5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher公司)；載氣：高純氦氣，流量1.0 mL/min；柱溫：50 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以40 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源(EI)溫度：250 ℃，碰撞氣：氬氣，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲時(shí)間8 min，采用多反應(yīng)模式(MRM)監(jiān)測(cè)，通過(guò)優(yōu)化得到每個(gè)氯丙醇衍生物的最佳的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量。相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各種氯丙醇衍生物的定性定量離子對(duì)參數(shù)Table 1 Parameters of MRM for chloropropaneol derivatives

通過(guò)儀器配制的工作站，分別以標(biāo)準(zhǔn)品中3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP 的質(zhì)量(ng)對(duì)3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP 衍生物定量離子對(duì)峰面積與其相應(yīng)同位素定量離子對(duì)峰面積的比值進(jìn)行線性回歸計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪提取

氯丙醇酯存在于脂肪中，油脂類樣品可直接進(jìn)行前處理，其它含油脂類食品需要先提取其脂溶性成分，將氯丙醇酯提取出來(lái)，提取脂肪的方法主要依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.2 分析條件

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯丙醇酯衍生物的MRM色譜圖Fig.1 The MRM chromatograms of chloropropaneols derivatives in standard solution

氯丙醇衍生物是弱極性化合物，色譜柱采用弱極性的TG -5MS毛細(xì)管柱,升溫程序采用二階升溫，選定條件下全部8種氯丙醇衍生物在16 min內(nèi)出峰，分離良好。第二階升溫是為保護(hù)色譜柱，將樣品測(cè)定液中的高沸點(diǎn)雜質(zhì)趕出色譜柱。相關(guān)色譜圖見(jiàn)圖1。

根據(jù)子彈的彈道模型,利用Matlab軟件編制子彈飛行彈道仿真程序,該程序在給出拋射點(diǎn)的母彈速度、拋射高度、拋撒時(shí)間、彈道傾角的條件下,應(yīng)用四階龍格庫(kù)塔法可解得子彈彈道;進(jìn)而通過(guò)畫圖程序生成落點(diǎn)分布、各枚子彈在三個(gè)坐標(biāo)的變化以及分速度的變化坐標(biāo)圖。圖2為計(jì)算子彈彈道仿真流程圖。

2.3 分析方法的識(shí)別點(diǎn)數(shù)

本方法通過(guò)使用來(lái)自兩個(gè)氯丙醇衍生物一級(jí)離子的二級(jí)質(zhì)譜離子對(duì)，遵循了歐盟委員會(huì)指令(96/23/EC)[11]，并為每種化合物提供4個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。

2.4 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括母離子、子離子、碰撞能量等。分別使用5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理程序水解、凈化、濃縮、衍生后進(jìn)行方法優(yōu)化。選擇最佳碰撞能量，每個(gè)化合物選擇1個(gè)定量離子對(duì)，1個(gè)定性離子對(duì)。本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，有效排除了復(fù)雜本底對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、回收實(shí)驗(yàn)與精密度

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)及檢出限等見(jiàn)表2。使用未檢出氯丙醇酯的油樣做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，進(jìn)行2個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，低、高二種濃度加標(biāo)回收率均在在87.6%～106.4%之間，滿足相關(guān)要求。

表2 各種氯丙醇衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限Table 2 Parameters of calibration curves for chloropropaneol derivatives

*The detection limits corresponding to concentration giving signal to noise of 3 divided by sample weight(0.1 g).

2.6 凈化效果

用硅藻土基質(zhì)分散固相萃取柱凈化樣品，樣品本底干擾少，連續(xù)測(cè)定100余份樣品后，樣品本底無(wú)升高，目標(biāo)化合物保留時(shí)間沒(méi)有漂移，檢測(cè)器等整個(gè)系統(tǒng)靈敏度未下降，說(shuō)明凈化效果良好。

2.7 樣品測(cè)定

采用本文方法對(duì)FAPAS樣品T2642QC進(jìn)行了測(cè)定，其3-MCPD酯賦值是0.579 mg/kg，測(cè)定值為0.597 mg/kg。對(duì)山東省2015年部分油脂類食品植物油、奶粉、方便面、油條、麻花、馓子進(jìn)行了分析測(cè)定，部分食品中檢出了3-MCPD酯和2-MCPD酯，3-MCPD酯最高值是9.34 mg/kg，2-MCPD酯最高值是6.79 mg/kg，沒(méi)有檢出1,3-DCP酯和2,3-DCP酯。

3 結(jié)論

采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定氯丙醇酯，降低了復(fù)雜本底對(duì)檢測(cè)的干擾，提高了檢測(cè)靈敏度，同位素內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確，硅藻土基質(zhì)分散固相萃取柱凈化效果好。

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[8] GB/T 5009.6-2003.Determination of Fat in Foods(食品中脂肪的測(cè)定).

[9] GB/T 5009.56-2003.Method for Analysis of Hygienic Standard of Pastry(糕點(diǎn)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法).

[10] GB/T 5413.3-2010.Determination of Fat in Foods for Infantsr and Yound Children Milk and Milk products(嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測(cè)定).

[11] European Commission Decision,2002/657/EC,Implementing Council Directive96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results,Offic J Eur Commun.L221(2002)8.