金納米簇增強的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)及在葡萄糖檢測中的應(yīng)用

孔亞訪， 樊愛萍*

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence,CL)分析法是近年來非?；钴S的一個研究領(lǐng)域，該方法具有儀器設(shè)備簡單、操作簡便、檢測靈敏度高等優(yōu)點[1]。魯米諾(Luminol)-H2O2是應(yīng)用最為廣泛的CL體系之一。但在沒有催化劑存在下，它們之間的反應(yīng)緩慢，產(chǎn)生的CL信號較弱。很多物質(zhì)能催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，包括金屬離子[2 - 3]和酶[4]等，但以辣根過氧化物酶(HRP)的應(yīng)用最為廣泛。HRP已被廣泛用于H2O2和葡萄糖的檢測[5]，也被用于構(gòu)建化學(xué)發(fā)光免疫分析方法[6]。天然的酶具有分離提純困難、易失活等缺點。近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)很多納米微粒具有擬過氧化物酶的活性，如Au納米微粒[7]、CuO納米微粒[8]、Co3O4納米微粒[9]、Ag納米微粒[10]等都能催化Luminol-H2O2反應(yīng)。納米微粒與天然酶相比，具有價格便宜、性質(zhì)穩(wěn)定的特點。研究表明，納米微粒擬過氧化物酶的催化活性受其尺寸大小、結(jié)構(gòu)、形貌和表面修飾等因素影響，粒徑小的納米粒子表面具有更多的活性催化位點，因而具有更高的催化活性。

金屬納米簇是在一定分子層的保護下，由幾個到幾百個金、銀和鉑等金屬原子所組成的相對穩(wěn)定的聚集體，其粒徑一般小于2 nm，尺寸接近金屬電子的費米波長，被認(rèn)為是連接金屬原子和納米顆粒的橋梁。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)金納米簇(Au NCs)能催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，得到增強的CL信號。Au NCs 與其它納米微粒催化的Luminol-H2O2反應(yīng)相比，催化Luminol-H2O2產(chǎn)生的是慢化學(xué)發(fā)光信號。基于此反應(yīng)，本文發(fā)展了簡單、方便的化學(xué)發(fā)光測定H2O2的新方法，并將其應(yīng)用于葡萄糖的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

BPCL微弱化學(xué)發(fā)光測定儀(中國科學(xué)院物理研究所);Carry-100 VARIAN紫外-可見分光光度計(美國，瓦里安公司)；F-7000熒光分光光度計(日本，日立公司)；H-800透射電鏡(日本，日立公司)；Zetasizer Nano ZSP粒度分析儀(英國，馬爾文)。

牛血清白蛋白(BSA)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，HAuCl4購自天津希恩思生化科技有限公司，葡萄糖氧化酶(GOx,100～250 U/mg)購自上海源葉生物科技有限公司，D -葡萄糖、乳糖、木糖和甘露糖購自北京索萊寶科技有限公司，Luminol購自阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司。NaOH、HCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl等試劑均為分析純，購自天津江天化工試劑有限公司。30%H2O2購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(10 mmol/L，pH=7.4)：分別稱取0.4 g NaH2PO4·2H2O，6 g Na2HPO4·12H2O和9 g NaCl，加水溶解后，定容至1 000 mL。Tris-HCl緩沖溶液(0.1 mol/L)：稱取1.2114 g Tris，用50 mL超純水溶解后，用1 mol/L HCl調(diào)至所需pH，最后用超純水定容至100 mL。去離子水由Milli-XQ純水儀制備。

1.2 Au NCs的制備

采用文獻報道的方法[11]，制備BSA穩(wěn)定的Au NCs。將一定體積50 mg/mL BSA和10 mmol/L HAuCl4分別在37 ℃水浴中孵育至恒溫后，取2 mL HAuCl4溶液，于磁力攪拌下加入2 mL BSA溶液中，于37 ℃ 攪拌2 min后，加入200 μL 1 mol/L的NaOH溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24 h，溶液顏色由無色轉(zhuǎn)變?yōu)樯詈稚瑒t表明形成了Au NCs。得到的產(chǎn)物采用截留分子量為10 000的超濾管超濾至濾液顯中性，除去NaOH和未反應(yīng)的HAuCl4。最終產(chǎn)物，分別采用紫外-可見分光光度法、熒光分光光度法和透射電鏡進行表征。為方便計算將其濃度計為1×BSA-Au NCs。于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 H2O2的測定

將50 μL 2.5 mmol/L Luminol溶液(pH=9.0的Tris-HCl緩沖溶液稀釋)與50 μL不同濃度H2O2溶液(pH=7.4的PBS稀釋)在測量杯中混勻，再向其加入100 μL 1/3×BSA-Au NCs(pH=9.0的Tris-HCl緩沖溶液稀釋)，同時通過化學(xué)發(fā)光儀收集并記錄反應(yīng)產(chǎn)生的光強度信號?；瘜W(xué)發(fā)光儀的測量高壓設(shè)定為-850 V，測量間隔設(shè)定為10 s。

1.4 葡萄糖的測定

在25 μL不同濃度的葡萄糖溶液(pH=7.4 PBS稀釋)中，加入25 μL 0.1 U/μL的GOx(pH=7.4 PBS稀釋)，混勻后37 ℃孵育5 min。將所得溶液與50 μL 2.5 mmol/L Luminol溶液(pH=9.0 Tris-HCl緩沖溶液稀釋)在測量杯中混勻，再向其加入100 μL 1/3×BSA-Au NCs(pH=9.0 Tris-HCl緩沖溶液稀釋)，同時通過化學(xué)發(fā)光儀收集并記錄反應(yīng)產(chǎn)生的光強度信號。參數(shù)設(shè)定同1.3節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au NCs的表征

圖1是所制備Au NCs的紫外-可見和熒光光譜表征結(jié)果。用紫外-可見分光光度計掃描Au NCs在250～700 nm范圍內(nèi)的吸收光譜，Au NCs在280 nm處有一強寬峰，歸屬于BSA的酪氨酸殘基和色氨酸殘基[12]，并無表面等離子體共振吸收峰，表明產(chǎn)物中不含有粒徑大于2 nm的較大粒徑的金納米微粒。采用熒光分光光度計測定了Au NCs的熒光光譜(圖1)。激發(fā)波長為360 nm，測定波長范圍為550～700 nm，結(jié)果表明所制得的Au NCs在650 nm處有一較寬的熒光發(fā)射峰，此峰為Au NCs的特征峰，與文獻報道[13]一致。采用透射電鏡(TEM)對Au NCs進行了表征(圖2)，所制得的Au NCs分散良好，粒徑均一，平均粒徑為1.85±0.32 nm。

圖1 Au NCs的吸收光譜和熒光光譜(激發(fā)波長為360 nm)Fig.1 Absorption spectra and fluorescence spectra(excitation wavelength is 360 nm) of Au NCs

圖2 Au NCs的透射電鏡(TEM)圖Fig.2 TEM image of Au NCs

2.2 Au NCs催化Luminol反應(yīng)的動力學(xué)曲線

圖3 不同反應(yīng)條件下魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curve of luminol CL reaction under different experimental conditionsExperimental conditions:) 2.5 mmol/L Luminol+1 mmol/L H2O2;) 2.5 mmol/L Luminol+400 μmol/L H2O2+1/3×Au NCs;) 2.5 mmol/L Luminol+1 mmol/L H2O2+1/3×Au NCs.

圖3為各種實驗條件下Luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動力學(xué)曲線。由圖可見，Luminol在堿性條件下雖被H2O2氧化，但得到的CL信號非常弱。在相同實驗條件下加入3倍稀釋的Au NCs后，CL信號得到了顯著增強，表明Au NCs 對Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有增強作用，且化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線顯示其為慢化學(xué)發(fā)光，測定10 min其化學(xué)發(fā)光信號仍未衰減。Zhang等[7]曾報道了金納米微粒能催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。為了比較Au納米微粒與Au NCs在Luminol-H2O2體系中的催化性質(zhì)，我們采用檸檬酸三鈉還原法制備了Au納米微粒，動態(tài)光散射法測定其粒徑為14±1.2 nm。與文獻報道一致，Au納米微粒能催化Luminol-H2O2體系產(chǎn)生快化學(xué)發(fā)光信號，其信號在15 s內(nèi)約衰減70%。Au NCs與Au納米微粒相比，催化Luminol-H2O2產(chǎn)生慢化學(xué)發(fā)光，其信號在10 min 內(nèi)仍無衰減。推測可能是Au NCs的粒徑非常小，導(dǎo)致與較大粒徑的Au納米微粒有不同的催化活性。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)Au NCs-Luminol-H2O2的CL信號強度也與H2O2的濃度相關(guān)。因此，基于Au NCs增強的Luminol-H2O2體系，本研究發(fā)展了H2O2的化學(xué)發(fā)光檢測方法，并將其應(yīng)用于葡萄糖的檢測。

2.3 H2O2檢測條件優(yōu)化

首先，對Luminol和Au NCs稀釋液Tris-HCl的pH進行了優(yōu)化。當(dāng)Tris-HCl的pH<8.0時，體系的化學(xué)發(fā)光信號弱；當(dāng)Tris-HCl的pH=8.0～9.0時，體系的化學(xué)發(fā)光信號顯著增強。這是因為堿性條件有利于Luminol的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；當(dāng)Tris-HCl的pH>9.0時，雖然體系的化學(xué)發(fā)光信號強度仍有緩慢上升，但信噪比顯著下降。因此，Tris-HCl的pH選定為9.0。之后，考察了Au NCs稀釋倍數(shù)對H2O2測定的影響。Au NCs稀釋倍數(shù)為3、6、12及24倍時，體系的化學(xué)發(fā)光信號隨的稀釋倍數(shù)增大而減小。結(jié)果表明，較大濃度的Au NCs有利于H2O2的測定，實驗選定稀釋倍數(shù)為3倍。最后，在0.01～2.5 mmol/L范圍內(nèi)考察了Luminol濃度對H2O2測定的影響。結(jié)果表明，體系的化學(xué)發(fā)光信號隨Luminol濃度的增大顯著增強，空白信號雖然也會在0.01～2.5 mmol/L范圍內(nèi)，體系的信噪比隨濃度的增大而增大。選擇Luminol的濃度為2.5 mmol/L。

2.4 檢測H2O2的工作曲線及重現(xiàn)性

圖4 (A)不同H2O2濃度下的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線；(B)H2O2濃度為5～100 μmol/L時體系化學(xué)發(fā)光強度的柱形圖Fig.4 (A) Kinetic curves of the different concentrations of H2O2;(B) Histogram of CL intensity vs concentration of H2O2Experimental conditions were the same as described in section 1.3.

在以上優(yōu)化的實驗條件下，對H2O2測定的線性范圍、靈敏度和重現(xiàn)性進行了考察。圖4(A)為H2O2濃度在200～1 000 μmol/L范圍內(nèi)，體系的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線。結(jié)果表明，隨著H2O2濃度的增加，體系的化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強，并且均顯示為慢化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其信號在10 min內(nèi)均無衰減(H2O2濃度小于200 μmol/L的動力學(xué)曲線圖中未顯示)。圖4(B) 為H2O2濃度在5～100 μmol/L范圍內(nèi)體系化學(xué)發(fā)光信號強度的柱形圖，其信號也是隨H2O2濃度的增加而增強。通過分析，發(fā)現(xiàn)H2O2的測定信號呈分段線性關(guān)系。H2O2濃度在10～100 μmol/L范圍內(nèi)，其線性方程為：ICL=14.908c-127.16，R2=0.9533；H2O2濃度在100～1 000 μmol/L范圍內(nèi)，線性方程為：ICL=161.23c-28820，R2=0.9439。采用3σ法計算，H2O2的檢測限為10 μmol/L。對200 μmol/L H2O2重復(fù)測定7次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.93%，表明所建立的方法重現(xiàn)性良好。

2.5 在葡萄糖檢測中的應(yīng)用

圖5 葡萄糖測定的化學(xué)發(fā)光信號響應(yīng)Fig.5 CL response of glucose detectionExperimental conditions were the same as described in section 1.4.

H2O2是葡萄糖氧化酶(GOx)在O2條件下與葡萄糖反應(yīng)的主要產(chǎn)物。因此，可將以上方法應(yīng)用于葡萄糖的化學(xué)發(fā)光檢測。測定包含兩步：第一步，GOx催化葡萄糖與O2反應(yīng)生成葡萄糖酸和H2O2；第二步，生成的H2O2與Au CNs 和Luminol反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。圖5為在PBS中測定葡萄糖所得信號的柱形圖，在10～1 000 μmol/L范圍內(nèi)葡萄糖濃度與化學(xué)發(fā)光信號的線性關(guān)系良好，回歸方程為：ICL=33.43c-2125.5，R2=0.95，檢測限為10 μmol/L。

之后，對此方法的選擇性進行了考察。在優(yōu)化的實驗條件下，分別考察了其他糖類如乳糖、木糖和甘露糖的CL信號響應(yīng)。實驗結(jié)果表明只有葡萄糖能產(chǎn)生很強的CL信號響應(yīng)，而乳糖、木糖和甘露糖的CL信號均與空白信號類似。本方法測定葡萄糖的選擇性良好，這源自于GOx催化葡萄糖與O2反應(yīng)生成H2O2具有高度的專一性。

最后，將所建立方法用于了人血清中葡萄糖含量的測定。將人血清樣品采用pH=7.4的PBS稀釋10倍后，按1.4所述方法進行檢測，結(jié)果分別為3.12±0.39、5.87±0.62、2.22±0.14 mmol/L；采用血糖儀測定的結(jié)果分別為2.9、6.0、2.3 mmol/L。說明所建立的方法可用于血清中葡萄糖含量的測定。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了簡單、方便的化學(xué)發(fā)光測定H2O2的方法。在優(yōu)化的實驗條件下，測定H2O2的檢測限為10 μmol/L。之后將此方法應(yīng)用于葡萄糖的檢測，測定葡萄糖的線性范圍為10～1 000 μmol/L，檢測限為10 μmol/L。該方法可用于血清中葡萄糖含量的測定。目前一些重要的生物分子如尿酸和乳酸等均能與相關(guān)酶反應(yīng)生成H2O2，本方法也能進一步拓寬至這些生物分子的檢測。除此之外，金納米簇催化的Luminol-H2O2的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為慢化學(xué)發(fā)光，其信號能在10 min內(nèi)保持穩(wěn)定，本課題組將致力于將其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光成像分析領(lǐng)域。

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