人工感染沙門菌牦牛脾中相關(guān)差異表達(dá)基因篩選

陳 通，朱育星，蔡雯祎，楊琦玥，鄧志和，蘭道亮

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041)

沙門菌屬于革蘭陰性菌，在自然界分布極廣，且菌屬型別繁多，抗原復(fù)雜[1]，是能引起人和多種動物致病的病原菌。在世界范圍內(nèi)，由沙門菌導(dǎo)致的食源性疾病一直排在細(xì)菌性食物中毒的首位[2]。牦牛沙門菌病，也稱為牦牛副傷寒(“小牛瘟”)，沙門菌主要在牦牛腸道生長繁殖，可通過腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)，并通過血液循環(huán)，導(dǎo)致全身感染，引起腹瀉、發(fā)熱及腸道炎癥反應(yīng)[3]。本病在我國牦牛繁衍區(qū)廣泛流行，幼齡牦牛和成年牦牛均能感染發(fā)病和造成死亡。其中對幼齡牦牛危害最為嚴(yán)重，致死率高，嚴(yán)重地危害著牦牛業(yè)的健康發(fā)展[4-6]。目前，尚無針對牦牛沙門菌病的有效疫苗，且不同血清型間無交叉免疫保護(hù)力，同時抗生素等藥物治療極易誘使沙門菌產(chǎn)生耐藥性，使得牦牛沙門菌病始終未能得到有效防控。此外，對于沙門菌免疫機(jī)制的研究多集中于雞、鼠等常規(guī)實驗動物，目前對于牦牛沙門菌的研究多集中于病原體本身[7-8]，對牦牛機(jī)體抵御沙門菌感染的相關(guān)免疫機(jī)制的研究尚未見任何報道。

同時，對沙門菌免疫機(jī)制的研究多為單一基因或通路。由于宿主抵御病原體感染的免疫反應(yīng)是一個復(fù)雜的作用機(jī)制，涉及許多分子及其信號通路，而這些分子及其信號通路又受許多基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，所以僅從單個或少數(shù)基因?qū)用媸菬o法深入挖掘機(jī)體抗感染免疫信息的，而在組學(xué)層面上加以描述才能更加有效地理解其中的作用機(jī)制[9]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，在功能基因組學(xué)層面上對感染后的組織或細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)基因，已逐漸被公認(rèn)為是鑒定機(jī)體抗感染免疫相關(guān)基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個有效工具[10-11]。同時隨著近期牦牛全基因組的釋放[12]，為牦牛的相關(guān)研究提供了可操作的藍(lán)圖。

鑒于此，本研究選取了高致病性的牦牛源御成門沙門菌作為模式病原體[13]，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)高通量技術(shù)篩選牦牛外周免疫器官脾感染沙門菌后的差異表達(dá)基因，并通過關(guān)聯(lián)分析鑒定出牦?？股抽T菌感染相關(guān)免疫基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步了解牦?？垢腥鞠嚓P(guān)分子免疫機(jī)制及牦牛重大疫病的分子抗病育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牦牛源御成門沙門菌swun3736菌株由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗室于2012年從牦牛糞便中分離,血清型經(jīng)四川省動物疫病預(yù)防控制中心鑒定。健康1月齡犢牦牛由西南民族大學(xué)青藏基地提供。

1.2 菌株培養(yǎng)

將御成門沙門菌菌株于37 ℃條件下，在SS平板劃線分離培養(yǎng)，挑選單菌落在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物感染與樣本采集

選取18只犢牛，用牛屬ELISA(賽默飛公司)試劑盒對其進(jìn)行常見疫病細(xì)菌(沙門菌、巴氏桿菌、大腸桿菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌)和病毒(腹瀉-黏膜病病毒、輪狀病毒)的相關(guān)抗體檢測，排除攜帶上述病原體的可能性。根據(jù)預(yù)試驗癥狀，選擇12、24、48 h三個時間取樣。將18只犢牛分為試驗組和對照組(各9頭)，分別于頸靜脈注射10 mL沙門菌菌液(約1×108CFU)和生理鹽水，然后分別在感染后12、24、48 h三個時間點隨機(jī)選取試驗組和對照組各3只犢牛，采集其脾樣本，放入液氮中保存。

1.4 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

用TRIzol(Life Technologies公司，美國)試劑提取脾樣本RNA，提取的RNA使用DNAse I(TaKaRa公司，大連)消化DNA后，用Oligotex mRNA小量提取試劑盒(Qiagen公司，德國)分離純化mRNA，然后使用Nanodrop ND-1000分光光度計對RNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行測定。用打斷試劑在恒溫混勻儀中對純化的mRNA進(jìn)行片段化，以打斷的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，純化和配對末端修復(fù)后，在cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭，進(jìn)行片段大小選擇后用PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的cDNA文庫經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100及 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后，在Illumina HiSeqTM2500平臺上對文庫進(jìn)行測序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

對Hiseq 2500測序產(chǎn)生的原始讀數(shù)進(jìn)行QC測試后，通過去除接頭序列、空序列及低質(zhì)量測序序列(≤Q20質(zhì)量值)，將原始讀數(shù)過濾為凈測序序列(Clean reads)。使用HISAT2軟件將凈測序序列比對到牦?；蚪M序列上，根據(jù)每條read在基因組上的位置統(tǒng)計染色體的測序深度。使用Bowtie2軟件將凈測序序列比對到參考基因序列上，對測序的整體質(zhì)量進(jìn)行評估。應(yīng)用Blast2 GO程序?qū)⒈葘ι系幕蚺cGO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，然后應(yīng)用WEGO程序?qū)@些基因涉及的主要生物學(xué)功能進(jìn)行GO分類注釋。通過與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫比對，對這些基因涉及的信號通路或代謝途徑(Pathway)進(jìn)行分析。最后進(jìn)行差異基因網(wǎng)絡(luò)互作分析，對18個樣本的所有差異基因進(jìn)行Soft power 值的篩選，然后通過以TOM矩陣進(jìn)行距離的劃分，得到基因之間的距離，再依照距離進(jìn)行模塊的劃分，根據(jù)WGCNA權(quán)重網(wǎng)絡(luò)分析得到各模塊內(nèi)基因間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，通過Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制。

2 結(jié) 果

2.1 RNA高通量測序基本數(shù)據(jù)分析

本研究對試驗組和對照組三個時間點共計18個樣本進(jìn)行測序并通過質(zhì)控。核苷酸組成分析顯示，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)總GC含量為54.62%。堿基組成和質(zhì)量分析表明，原始測序數(shù)據(jù)的堿基組成情況良好。高質(zhì)量測序序列的平均比例為97.12%，此結(jié)果說明測序質(zhì)量良好。將Clean reads比對到參考基因上，平均映射比率為80.17%，且測序序列均勻地覆蓋在參考基因上，說明此次序的整體質(zhì)量良好、測序數(shù)據(jù)隨機(jī)性良好，可用于后續(xù)的分析。

2.2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計

試驗組與對照組三個時間點差異基因篩選統(tǒng)計顯示，12 h篩選出77個差異表達(dá)基因，其中48個為上調(diào)，29個為下調(diào)。24 h篩選出134個差異表達(dá)基因，其中55個表現(xiàn)為上調(diào)，79個表現(xiàn)為下調(diào)。48 h篩選出202個差異表達(dá)基因，其中82個表現(xiàn)為上調(diào)，120個表現(xiàn)為下調(diào)。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能及pathway顯著性富集分析

GO分析表明(表1)，試驗組與對照組12 h差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3個大類36個小類，在生物過程類別中，最為富集的是細(xì)胞過程，其次是代謝過程、生物調(diào)節(jié)及生物過程的調(diào)控。試驗組與對照組24 h差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3 個大類44個小類，在生物過程類別中，最為富集的是細(xì)胞過程，其次是單一有機(jī)體過程及生物調(diào)節(jié)。試驗組與對照組48 h差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3個大類46個小類，在生物過程類別中，最為富集的是細(xì)胞過程，其次是單一有機(jī)體過程及生物調(diào)節(jié)。

表1各時間點生物學(xué)過程前十富集GO分類

Table1ClassificationofthefirsttenenrichedGObeforethebiologicalprocess

樣品Sample基因功能Genefunction基因數(shù)Numberofgenes對照組12hvs試驗組12hBiologicalregulation2412h-dzvs12h-SYCellularcomponentorganizationorbiogenesis13Cellularprocess37Localization13Metabolicprocess27Negativeregulationofbiologicalprocess12Positiveregulationofbiologicalprocess24Responsetostimulus19Signaling12Single-organismprocess32對照組24hvs試驗組24hBiologicalregulation58

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

KEGG注釋結(jié)果表明，試驗組與對照組12 h差異基因涉及96條通路, 富集前20的通路中，與感染、免疫相關(guān)的通路有5條，富集前3的通路與能量代謝有關(guān)。試驗組與對照組24 h差異基因涉及164條通路,富集前20的通路中，與感染、免疫相關(guān)的通路有9條，其他通路多與疾病相關(guān)。試驗組與對照組48 h差異基因涉及188條通路，富集前20的通路中，與感染、免疫相關(guān)的通路有3條，有6條通路與癌癥相關(guān)，其他通路多與疾病相關(guān)(表2)。

2.4 差異表達(dá)基因WGCNA分析

WGCNA分析顯示，處于網(wǎng)絡(luò)樞紐的基因共66個，處于網(wǎng)絡(luò)中心的基因是SCOC和NOCT(圖1)。

3 討 論

脾免疫是動物抵御外界病原體感染重要機(jī)制，在機(jī)體抗感染免疫中具有重要地位。本研究以牦牛源御成門沙門菌為模式病原體，采用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)RNA-Seq對感染牦牛脾組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出差異表達(dá)基因，在組學(xué)層面上探討了牦牛脾細(xì)胞與御成門沙門菌的互作機(jī)制。

3.1 差異表達(dá)基因的GO分析

試驗組和對照組進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO分析顯示，注射沙門菌12 h后，生物學(xué)過程的富集類別多與細(xì)胞對于病原的反應(yīng)相關(guān)，分子功能中最為富集的是綁定類別及催化類別，推測綁定類別及催化作用在該時期的機(jī)體抗感染機(jī)制中有著重要的作用。

24 h后，宿主發(fā)生炎癥反應(yīng)，生物過程類別與12 h時幾乎一致，但增加了細(xì)胞殺傷。分子功能類別增加了4個與信號傳遞相關(guān)的類別，推測該時期細(xì)胞的凋亡及信號傳遞十分重要。

48 h后，試驗組臨床表現(xiàn)和病變較對照組更為劇烈，功能類別與24 h的分析沒有太大區(qū)別，但差異基因數(shù)量顯著增加，分子功能類別增加了趨化因子活性和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，缺少了結(jié)構(gòu)分子活性，推測該時期分子的趨化作用及核酸轉(zhuǎn)錄對機(jī)體抗感染機(jī)制非常重要。

3.2 差異表達(dá)基因的KEGG分析

差異表達(dá)基因KEGG分析顯示，注射沙門菌12 h后，與感染、免疫相關(guān)的富集通路有TGF-β信號通路、PI3K-Akt信號通路、NOD-like受體信號通路、吞噬體、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用。其中，TGF-β信號通路、NOD-like受體信號通路所涉及的差異基因都表現(xiàn)為下調(diào)，包括Rbx1、RANTES、BMP。Rbx1是E3泛素連接酶的重要組成部分，通過促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的及時降解來激活E3泛素連接酶并參與泛素化過程，同時泛素連接酶E3還涉及多種疾病的發(fā)病機(jī)制[14]。RANTES是趨化性細(xì)胞因子CC亞族成員，能趨化或刺激多種白細(xì)胞。這些基因的下調(diào)推測是受到了沙門菌的抑制，具體機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步研究。PI3K-Akt信號通路和吞噬體涉及的差異基因表現(xiàn)為上調(diào)，這些差異基因包括Gβγ和F-actin。Gβγ與Gα亞基組成的異三聚體G蛋白能傳遞G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的信號，從而調(diào)節(jié)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等的生理反應(yīng)[15-16]。F-actin是細(xì)胞骨架的成分之一，對CD4+T細(xì)胞形態(tài)的維持、物質(zhì)的運輸、細(xì)胞的運動，以及病毒侵染等過程具有重要作用[17]。這些基因的上調(diào)，說明宿主的免疫細(xì)胞開始激活分化。

沙門菌感染的一個重要特征是腸道炎癥[3]，此時通路炎性腸病也有富集表現(xiàn)，其涉及的差異基因為TCR、NOD2，TCR和NOD2都是重要的天然免疫受體。TCR/CD3復(fù)合物能誘導(dǎo)T細(xì)胞激活、刺激誘導(dǎo)NF-κB信號通路，此時大部分TCR上調(diào)，是感染初期宿主發(fā)現(xiàn)沙門菌入侵后的快速免疫應(yīng)答。有少量TCR表現(xiàn)為下調(diào)，猜測可能是沙門菌為躲避免疫系統(tǒng)監(jiān)視而產(chǎn)生的抑制作用。

此外，本階段最為富集的通路為氧化磷酸化通路、非酒精性脂肪肝通路和心肌收縮通路，這三條通路涉及的差異基因較為相似，主要是細(xì)胞色素c氧化酶，其中COX3和COX7c表現(xiàn)為下調(diào)，其余差異基因都表現(xiàn)為上調(diào)。細(xì)胞色素c氧化酶上調(diào)能促進(jìn)線粒體的氧化磷酸化作用，而氧化磷酸化系統(tǒng)是細(xì)胞能量產(chǎn)生的最終生化途徑，能為部分免疫細(xì)胞的分化提供能量。大量研究表明，病原體感染宿主細(xì)胞后對宿主能量代謝的影響主要是對氧化磷酸化作用的抑制。COX3和COX7c的下調(diào)，推測是受到了沙門菌的抑制。

24 h后，與感染、免疫相關(guān)的富集通路有細(xì)胞因子受體相互作用、TNF信號通路、趨化因子信號通路、Toll-like受體信號通路、沙門菌感染、NOD-like受體信號通路、NF-κB信號通路、Jak-STAT信號通路、細(xì)胞凋亡。分析它們所涉及的差異基因，發(fā)現(xiàn)此時參與免疫的主要是趨化因子。趨化因子能讓細(xì)胞遷移至炎性部位，且能與其受體結(jié)合參與多種病理過程，對免疫細(xì)胞分化有重要作用[18]。其中，涉及到大多數(shù)通路的是IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子，這些炎性因子都表現(xiàn)為上調(diào)。IL-1能激活抗原遞呈細(xì)胞、促進(jìn)T、B細(xì)胞生長及免疫球蛋白的合成[19]。IL-6、IL-8能調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞趨化因子的生成，促使中性粒細(xì)胞遷移至感染局部，參與炎癥反應(yīng)[20-21]。IL-1β和TNF-α可以誘導(dǎo)NF-κB通路，促進(jìn)炎性因子的分泌，IL-1和TNF-α還能激活凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。這些炎性因子的上調(diào)，說明宿主正處于炎癥階段，以此抵抗沙門菌。

有研究表明，Toll樣受體信號通路中的TLR4能識別革蘭陰性菌并影響IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子的釋放[23-24]，但此時試驗組與對照組相比，TLR4并無明顯差異，而該通路的下游基因IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等都顯示為上調(diào)，推測TLR4可能在此階段之前發(fā)生過變化，但本次研究并未捕捉到。在24 h階段，CCL2也涉及多個富集通路，CCL2是在IL-8、TNF-α等炎癥因子的刺激下分泌，并積極誘導(dǎo)免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的趨化因子[25]。本階段IL-8、TNF-α都表現(xiàn)為上調(diào)，但CCL2卻表現(xiàn)為下調(diào)，推測沙門菌對其有抑制作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

48 h后，與感染、免疫相關(guān)的富集通路有PI3K-Akt信號通路、吞噬體等。其中PI3K-Akt信號通路和吞噬體最為富集且涉及的差異基因眾多。這兩條通路涉及的差異基因都包含了TLR2，TLR2是TLRs家族的成員之一，是表達(dá)于天然免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等表面最重要模式識別受體，能刺激炎癥因子的合成，參與機(jī)體免疫[26]，此時TLR2表現(xiàn)為下調(diào)，推測沙門菌感染對其有抑制作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，PI3K-Akt信號通路涉及的差異基因還包括IL6、G-CSF、IL2α、NF-κB、PDGF-B、PDGFRA、CSF-1R等，除CSF-1R表現(xiàn)為下調(diào)外，其它基因都表現(xiàn)為上調(diào)，其中，NF-κB基因?qū)C(jī)體免疫十分重要。NF-κB基因可在TLRs識別到細(xì)菌入侵后被激活[27]，其主要作用是對免疫和炎癥作用的調(diào)控，PI3K-Akt信號通路中的促炎癥因子IL6、G-CSF、IL2α等都在NF-κB的調(diào)控范圍之內(nèi)。IL6、G-CSF、IL2α等促炎癥因子還可以促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)生[28-29]。此外，IL-1β、TNF-α還可以通過激活或抑制NF-κB的活性來維持整個炎癥作用有效、有限的發(fā)生，以達(dá)到適度炎癥促進(jìn)免疫的目的，避免過度炎癥引發(fā)自身的免疫疾病或炎癥相關(guān)疾病[30-31]。吞噬體所涉及的差異基因還包括大量的整合素，這是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的黏附分子受體，其主要功能為細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞的生長和分化、炎癥、創(chuàng)傷愈合等[32]。然而，此時這些整合素大部分顯示為下調(diào)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

此外，48 h階段的富集通路中出現(xiàn)了許多與癌變相關(guān)的通路，如病毒致癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素、膀胱癌、急性骨髓性白血病等，這些癌癥相關(guān)通路大多都包含NF-κB基因，NF-κB和其信號通路中的大部分激活因子被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[33]。

此時氧化磷酸化通路的差異基因QCR10、COX1、COX7B、COX7C全部顯示為下調(diào)，推測此時宿主的能量代謝系統(tǒng)可能受到了抑制。

3.3 WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL-1A、IL-1B、IL-2RA、IL-6、IL-23A、TNF、CXCR5、CXCL3、CXCL8、CCL5、CCL20、CSF等都顯示為富集，這些基因可以在前文KEGG分析的富集通路中找到，驗證了KEGG分析的結(jié)果。SCOC和NOCT處于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，說明這兩個基因與其他富集基因的相關(guān)性最高。SCOC是一種高爾基體蛋白，通過與ARL1相互作用參與高爾基體運輸，SCOC能促進(jìn)自噬體的形成，自噬可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)細(xì)胞代謝功能[34]。NOCT是一種脫腺苷酶，通過參與代謝脂肪基因轉(zhuǎn)錄后的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)牽涉脂質(zhì)代謝的許多方面。NOCT在脂質(zhì)代謝、脂肪形成、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、炎癥和骨生成中發(fā)揮重要作用[35]。SCOC和NOCT的富集說明細(xì)胞代謝功能在整個免疫過程中起著重要作用。

4 討 論

以牦牛源御成門沙門菌為模式病原體，用RNA-Seq測序技術(shù)對感染牦牛的脾轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出牦牛感染御成門沙門菌后脾細(xì)胞的差異表達(dá)基因，在組學(xué)層面上探討了牦牛脾細(xì)胞與沙門菌的分子互作機(jī)制，為進(jìn)一步研究高原動物的免疫機(jī)制提供了依據(jù)。

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