臨床樣本中水貂嵌杯病毒的全基因組分析

王楷宬，莊青葉，邱 源，王素春，侯廣宇

(中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

嵌杯病毒科(Caliciviridae)病毒粒子一般呈球形或近球形，核衣殼呈二十面體對稱，直徑27～40 nm。電鏡觀察檢查時(shí)可見病毒粒子內(nèi)部的高密度區(qū)為許多明亮的相互交叉的線條，而低密度區(qū)是7個(gè)光線比較暗的凹陷，中央有1個(gè)，周圍存在6個(gè)，整體觀察構(gòu)成六芒星狀的圖像，其形態(tài)如同一個(gè)具有似花邊杯狀或花萼狀，故此又稱杯狀病毒。嵌杯病毒為單股、正鏈RNA病毒，其基因組大小約為7.5 kb。嵌杯病毒與微RNA病毒非常接近，以前歸類于微RNA病毒科。目前，嵌杯病毒科分為5個(gè)屬：水皰疹病毒屬(Vesivirus)、兔病毒屬(Lagovirus)、紐布病毒屬(Nebovirus)和2個(gè)人類的嵌杯病毒屬，即諾瓦病毒屬(Norovirus)和札幌病毒屬(Sappovirus)[1]。

水貂嵌杯病毒(mink calicivirus, MCV)是在美國的一個(gè)有出血性肺炎史卻一直未確定病原的水貂養(yǎng)殖場首次檢測到[2]。此種普通MCV通常不表現(xiàn)消化道的臨床癥狀，可能表現(xiàn)為肺炎等呼吸道癥狀。2000年，M.Guo等報(bào)道了一種能引起水貂腸炎的嵌杯病毒，被命名為水貂腸道嵌杯病毒(mink enteric calicivirus, MEC)[3]。MEC與MCV的病毒顆粒形態(tài)沒有差別，但是這兩種病毒的RNA多聚酶基因分析卻存在較大差異。MEC的RNA多聚酶區(qū)域與人札幌病毒和豬嵌杯病毒的氨基酸相似性在64%～71%，與水皰疹病毒相似性在40%～51%，與諾瓦病毒氨基酸相似性為29%～33%。而MCV的RNA聚合酶的氨基酸序列與水皰疹病毒的相似性最高，達(dá)到58%～81%，與諾瓦病毒的相似性在43%～51%；與兔病毒屬病毒的相似性在35%～37%；與諾瓦樣病毒相似性在27%～35%。結(jié)果表明MCV與水皰疹病毒親緣關(guān)系最近，MEC 所屬的科屬同札幌病毒的親緣關(guān)系最近。

國內(nèi)外對感染水貂的嵌杯病毒研究較少，我國僅徐貴財(cái)2007年在大連地區(qū)的某發(fā)病水貂養(yǎng)殖場檢測到該病原[4]，對病原特性和基因組特性進(jìn)行研究，并報(bào)道了世界上唯一的水貂嵌杯病毒全基因組序列[5]。本文對在青島地區(qū)檢測的一株水貂感染的嵌杯病毒的基因組進(jìn)行高通量測序和分析，以期深入了解我國水貂感染的嵌杯病毒的分子生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑均購自Life technologies公司；超凈工作臺(tái)(美國Forma Scientific)；移液器(Eppendorf)；孵化器(德州誠信孵化設(shè)備有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(德國Heraeus Biofuge primoR)；PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)。

1.2 核酸提取

自青島市某養(yǎng)貂場2016年春季采集的糞便樣品中檢測到水貂嵌杯病毒(Mink/China/2/2016)[6]，將該份樣品充分混勻后，經(jīng)高速離心和過濾去除大分子物質(zhì)和細(xì)菌，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德國)提取病毒核酸，-80 ℃保存。

1.3 高通量測序(NGS)文庫構(gòu)建

提取的病毒核酸采用中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心報(bào)道的方法[6]構(gòu)建NGS文庫。具體方法：8 μL病毒RNA加入1 μL 100 μmol·L-1引物A15N6和2 μL無核酸酶的水進(jìn)行混合，72 ℃ 5 min，然后RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min；混合物加入4 μL 5×first-strand buffer, 1 μL dNTP (100 μmol·L-1), 2 μL DTT (0.1 mol·L-1), 1 μL RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor (40 U·μL-1) 和 1 μL SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase (200 U·μL-1) (Invitrogen, USA), 25 ℃反應(yīng)15 min，42 ℃反應(yīng) 30 min，70 ℃ 15 min終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物中再加入1 μL RNase H (TaKaRa, Japan)，37 ℃反應(yīng)20 min；采用DynaMagTM-2 Magnet和Agencourt?AMPure?XP Reagent (Beckman Coulter, USA)純化合成的第一鏈cDNA；純化的第一鏈cDNA中加入引物B15N6，70 ℃ 5 min；再加入1 μL Klenow fragment (5 U) (NEB, USA), 5 μL 10 × NEBuffer 2, 2 μL dNTP (100 μmol·L-1) 和 1 μL DTT (0.1 mol·L-1)，37 ℃反應(yīng)30 min；最后采用1 × Phusion High-Fidelity Buffer, 10 μmol·L-1引物A30和B30(表1), 0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, USA)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用E-Gel?SizeSelectTMAgarose Gel進(jìn)行電泳，篩選和回收約450 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物作為NGS文庫。

1.4 NGS測序

將NGS文庫稀釋為26 pmol·L-1，應(yīng)用Ion PGM Template OT2 400 Kit對DNA文庫進(jìn)行測序前的樣品處理。處理后的樣品加至Ion 316芯片，置于PGM測序儀進(jìn)行測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

NGS測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，采用CLC genomics workbench 8.5.1(Qiagen, Germany)將測序得到的reads參考GenBank中已發(fā)表的水貂嵌杯病毒MCV-DL/2007/CN全基因序列[5](GenBank登錄號(hào)：NC_019712)進(jìn)行mapping 拼接，并分析拼接完成的基因組中的ORF，注釋后的序列提交GenBank。

1.6 基因組特性分析

采用MEGA 6.0[7]將Mink/China/2/2016的全基因與衣殼蛋白氨基酸序列分別與GenBank中嵌杯病毒科的代表毒株(表2)的全基因與衣殼蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對和進(jìn)化分析，并對這些毒株的衣殼蛋白氨基酸序列之間的p-distance進(jìn)行分析。同時(shí)，將Mink/China/2/2016的RdRP氨基酸序列通過BLAST比對，分析該病毒是否屬于MEC。

表1引物與引物序列

Table1Primeranditssequence

引物名稱Primername引物序列PrimersequenceA15N65'-GTGTCTCCGACTCAGNNNNNN-3'B15N65'-TGGGCAGTCGGTGATNNNNNN-3'A305'-CCA/TCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3'B305'-CCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'

表2基因比較分析所使用的嵌杯病毒毒株

Table2Thevirusesusedinthegenomecomparison

病毒名稱Virus病毒名稱縮寫Abbreviationofvirus毒株名Isolatename宿主HostGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionnumberICTV分類ICTVclassification貓嵌杯病毒FCVUrbana貓NC_001481水皰疹病毒屬豬水皰疹病毒VESVA48豬U76874水皰疹病毒屬犬嵌杯病毒CaCV犬NC_004542水皰疹病毒屬水貂嵌杯病毒MCVMCV-DL/2007/CN水貂NC_019712水皰疹病毒屬兔出血癥病毒RHDVRHDV-FRG兔NC_001543兔病毒屬歐洲野兔綜合征病毒EBHSV兔NC_002615兔病毒屬諾如病毒Norovirus人NC_001959諾瓦病毒屬札幌病毒SapporoMc10人NC_010624札幌病毒屬豬腸道札幌病毒PESVCowden豬NC_000940札幌病毒屬紐伯里1病毒NBV牛NC_007916紐布病毒屬牛嵌杯病毒BCVKirklareli牛NC_030793紐布病毒屬鵝嵌杯病毒GCVN鵝NC_024078未分類大西洋鮭魚嵌杯病毒ASCVNordland/2011鮭魚NC_024031未分類海象嵌杯病毒W(wǎng)CV海象NC_004541未分類兔嵌杯病毒RCVMIC-07兔NC_011704未分類豬嵌杯病毒SCVpig/AB90/CAN豬NC_012699未分類牛腸道嵌杯病毒BECVTCG牛NC_006875未分類雞嵌杯病毒CCVRS/BR/2015雞NC_033081未分類杜蘭病毒TulaVTulanevirus猴EU391643未分類

2 結(jié) 果

2.1 基因組解析

芯片上樣率為73%，測序文庫得到質(zhì)量較高的序列數(shù)據(jù)測序數(shù)據(jù)。CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到水貂嵌杯病毒中國株的全基因大小為8 427 bp，GenBank登錄號(hào)為 MF677852。Mink/China/2/2016基因組具有與其他嵌杯病毒相似的結(jié)構(gòu)和基因順序，其5′端有帽子結(jié)構(gòu)，與結(jié)合蛋白VPg共價(jià)結(jié)合，其3′端為聚A尾，基因組(圖1)中主要包含3個(gè)ORF。ORF1(14—5 851)編碼1 946 個(gè)氨基酸的多聚蛋白，包括AAA-like蛋白、RNA解旋酶(RNA helicase)、Walker A 模體、Walker B模體、ATP結(jié)合位點(diǎn)、多肽酶(peptidase)、蛋白酶(protease)和RNA依賴的RNA多聚酶(RdRP)；ORF2(5 857—7 899)編碼包含衣殼蛋白(coat protein)的681個(gè)氨基酸；ORF3編碼59個(gè)氨基酸。

圖1 Mink/China/2/2016基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Genome structure of Mink/China/2/2016

2.2 基因組比較分析

Mink/China/2/2016與19株代表性毒株(表2)的全基因組進(jìn)化分析結(jié)果見圖2，衣殼蛋白氨基酸序列的進(jìn)化分析見圖3，各毒株衣殼蛋白氨基酸序列之間的p-distance進(jìn)行分析結(jié)果見圖4。全基因序列進(jìn)化分析與衣殼蛋白氨基酸序列進(jìn)化分析結(jié)果一致，說明僅分析衣殼蛋白氨基酸序列就能夠反映嵌杯病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系。Mink/China/2/2016與已報(bào)道全基因的1株水貂嵌杯病毒(MCV DL/2007/CN)親緣關(guān)系最近，兩株水貂嵌杯病毒與VESV、WCV、FCV、CaCV歸為同一分支。此分支各毒株衣殼蛋白氨基酸序列間的p-distance均小于0.7，該屬衣殼蛋白氨基酸序列與其他屬間的p-distance大于0.7，按照ICTV第九次病毒分類報(bào)告中嵌杯病毒科中各屬的分類標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)將水貂嵌杯病毒與VESV、WCV、FCV、CaCV歸為水皰疹病毒屬。BLAST結(jié)果顯示，Mink/China/2/2016為MCV，其RdRP氨基酸序列與MCV較近，與MEC較遠(yuǎn)。

同時(shí)，對表2中8種ICTV未分類的嵌杯病毒分析發(fā)現(xiàn)：WCV歸為水皰疹病毒屬；BECV歸為紐布病毒屬；GCV和CCV歸為一個(gè)單獨(dú)的新屬；RCV歸為兔病毒屬；ASCV、SCV和TulaV按照ICTV分類標(biāo)準(zhǔn)不屬于任一已知的屬。

▲. 水貂嵌杯病毒株Mink/China/2/2016；●. ICTV未確定屬的嵌杯病毒▲. Mink calicivirus isolate Mink/China/2/2016；●. Caliciviruses which had not classified by ICTV圖2 嵌杯病毒全基因進(jìn)化分析Fig.2 Genome evolution analysis of caliciviruses

▲. 水貂嵌杯病毒中國株Mink/China/2/2016；●. ICTV未確定屬的嵌杯病毒▲. Mink calicivirus isolate Mink/China/2/2016；●. Caliciviruses which had not classified by ICTV圖3 嵌杯病毒衣殼蛋白氨基酸序列進(jìn)化分析Fig.3 Capsid protein amino acid evolution analysis of caliciviruses

圖4 Mink/China/2/2016 與嵌杯病毒代表毒株衣殼蛋白氨基酸序列分析Fig.4 P-distance analysis of the capsid protein amino acid sequence of Mink/China/2/2016 and the representative caliciviruses

3 討 論

嵌杯病毒可引起包括人類、貓、豬、海洋哺乳動(dòng)物、兔、野兔、牛、犬、爬行類、兩棲類和昆蟲等多個(gè)物種的呼吸道病、水皰、壞死性肝炎和胃腸炎等疾病。嵌杯病毒的感染常常持久，癥狀可能不明顯、輕微，也可能嚴(yán)重[8]。對人、豬、貓、兔和豬等動(dòng)物感染的嵌杯病毒的研究報(bào)道較多，但對水貂感染的嵌杯病毒的報(bào)道國內(nèi)外僅有3篇文獻(xiàn)對此進(jìn)行描述和研究。J. F. Evermann等[2]最先從水貂分離到嵌杯病毒，并發(fā)現(xiàn)分離到的水貂杯狀病毒具有非常特殊的生物學(xué)特性，能夠與人O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，不能凝集雞、鵝、兔、豬、牛、山羊、綿羊、犬、大鼠、豚鼠的紅細(xì)胞，該生物學(xué)特性的發(fā)現(xiàn)是本科屬繼兔出血熱病毒之后第二個(gè)具有能夠凝集紅細(xì)胞特性的病毒。該毒株還具有廣泛的細(xì)胞嗜性、血凝特性以及感染細(xì)胞表現(xiàn)出來得迅速致成 CPE 現(xiàn)象等，對于該病毒的研究將具有非常重要的意義。之后，M. Guo等[3]又發(fā)現(xiàn)了能引起水貂腸炎的新型嵌杯病毒MEC，并認(rèn)為MCV屬嵌杯病毒科札幌病毒屬。2011年，B. C. Yang等[5]報(bào)道了我國的一株MCV的全基因組。

為深入了解水貂嵌杯病毒的特性，本文從我國青島地區(qū)水貂養(yǎng)殖場檢測到一株嵌杯病毒，并采用高通量測序方法獲得該病毒的全基因，也是世界上第二個(gè)報(bào)道的MCV全基因序列。從全基因分析結(jié)果來看，在青島檢測到的毒株與2011年報(bào)道的大連株全基因序列相似性極高，都屬于水皰疹病毒屬成員。編碼的3個(gè)ORF的大小相同，僅由于氨基酸序列變化而存在微小的差異。說明MCV在我國的不同區(qū)域和不同時(shí)間的流行毒株變異非常小，若研發(fā)防控此病的疫苗將在不同地區(qū)均具適用性。

本文還對現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的所有19種動(dòng)物嵌杯病毒進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，為分析8種ICTV未分類的嵌杯病毒(WCV、BECV、GCV、CCV、ASCV、SCV、RCV和TulaV)的分類地位提供基礎(chǔ)。根據(jù)分析結(jié)果推測，WCV和BECV分別屬于水皰疹病毒屬和紐布病毒屬。而禽源的兩種病毒GCV和CCV在進(jìn)化樹上屬同一分支，且兩者衣殼蛋白氨基酸序列p-distance 小于0.7，應(yīng)屬同一個(gè)屬，但與其他嵌杯病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。ASCV、SCV和TulaV衣殼蛋白氨基酸序列p-distance均大于0.7，但在進(jìn)化樹中與諾瓦病毒屬關(guān)系較近，是否可歸為諾瓦病毒有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

報(bào)道了世界上第二株水貂感染的嵌杯病毒全基因，同時(shí)對嵌杯病毒各屬的進(jìn)一步分類提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有利于了解我國流行的水貂嵌杯病毒的特性，進(jìn)一步明確其與其他嵌杯病毒的進(jìn)化關(guān)系。

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