2012—2016年中國(guó)南方地區(qū)帕利亞姆血清群病毒的分離與序列特征分析

楊 恒，肖 雷，李占鴻，孟錦昕，楊振興，呂敏娜，林栩慧，廖德芳，牛保生，李華春*

(1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650224;2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州510640；3. 云南省師宗縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，師宗655799)

帕利亞姆血清群病毒(Palyam serogroup virus, PALV)為呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)基因組分節(jié)段雙鏈RNA(dsRNA)蟲(chóng)媒病毒，廣泛分布于熱帶、亞熱帶與溫帶地區(qū)，可感染多種反芻動(dòng)物，其中以牛最為易感。病毒主要通過(guò)吸血昆蟲(chóng)庫(kù)蠓(Culicoides)對(duì)動(dòng)物的吸血性叮咬傳播[1-2]。PALV具有多種不同的血清型，由于歷史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分離地的地名進(jìn)行命名，因此容易讓人誤認(rèn)為它們是不同類型的病毒，但實(shí)際為同一種病毒的不同血清型。目前報(bào)道的PALV血清型有Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)、Bunyip Creek virus(BCV)、CSIRO Village virus、Petevo virus、Gweru virus、Marondera virus、Marrakai virus、Abadina virus以及Vellore virus[3]。

CHUV于1985年首次從日本中山縣庫(kù)蠓C.oxystoma和牛血液中分離獲得，因而命名為中山病毒[4]。CHUV為導(dǎo)致1985—1986年日本暴發(fā)的新生牛積水性無(wú)腦小腦發(fā)育不全綜合征(hydranencephaly cerebellar hypoplasia syndrome, HCH)的病原[5]，目前日本已經(jīng)研發(fā)了針對(duì)CHUV的滅活疫苗，用于控制本病的流行[6-7]。2007年韓國(guó)的一項(xiàng)家畜蟲(chóng)媒病毒血清學(xué)調(diào)查研究顯示，發(fā)生流產(chǎn)牛的CHUV抗體陽(yáng)性率為22.8%，認(rèn)為CHUV可能與牛的流產(chǎn)有一定的關(guān)系[8]。DAV與BCV最早分別于1970與1975年從澳大利亞的庫(kù)蠓C.oxystoma與C.peregrinus中分離。2016年，日本從監(jiān)控牛群與庫(kù)蠓上分離出多株DAV與BCV，證實(shí)了兩種病毒在日本的流行[9]。目前關(guān)于BCV與DAV致病性報(bào)道較少，推測(cè)兩種病毒可能與發(fā)生在牛上的流產(chǎn)有一定關(guān)系，但仍需進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證明[10]。

與環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血熱病毒(EHDV)類似[11]，PALV的基因組大小約21 kb，由Seg-1(3.9 kb)至Seg-10(0.7 kb)等10個(gè)基因節(jié)段構(gòu)成，可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)與三種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1～NS3)[12-14]。Seg-2編碼的VP2蛋白決定著PALV的血清型，誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的血清型特異性中和抗體，其核酸與氨基酸序列在不同血清型毒株之間高度變異。Seg-7編碼的VP7蛋白為PALV的群特異性抗原，可誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的群特異性抗體，其氨基酸序列在不同血清型之間高度保守，Seg-7核酸序列在不同地域分離的毒株之間存在著一定差異，體現(xiàn)出病毒的地域特征[15-16]。

2012年，我們從云南省師宗縣的監(jiān)控牛上首次分離出CHUV(SZ/187毒株)，并完成其全基因組序列測(cè)定[17]，隨后王芳(F.Wang)等[18]在項(xiàng)目設(shè)立于廣西壯族自治區(qū)馬山市的監(jiān)控牛中也分離出CHUV(GX871毒株)。通過(guò)對(duì)兩株中國(guó)CHUV毒株基因組序列的比較顯示，兩個(gè)毒株Seg-1至Seg-10基因節(jié)段的核酸序列相似度均大于99%，表明在我國(guó)云南與廣西流行的CHUV有著非常近的親緣關(guān)系。

為掌握PALV在我國(guó)大陸地區(qū)的分布、血清型與病毒的遺傳背景，2012—2016年我們?cè)谠颇?、廣東與廣西設(shè)立的監(jiān)控動(dòng)物牛上開(kāi)展了PALV的分離工作，相繼分離出19株P(guān)ALV。本文對(duì)我國(guó)PALV的分離、鑒定、Seg-2與Seg-7的序列特征進(jìn)行了報(bào)道，研究結(jié)果將有助于掌握我國(guó)PALV的分布、遺傳背景以及與世界范圍PALV毒株之間的關(guān)系，為PALV診斷試劑的開(kāi)發(fā)、流行病學(xué)調(diào)查與致病性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

磁珠法病毒RNA抽提試劑盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Thermo公司； RNA提取試劑RNAiso-Plus、病毒RNA/DNA抽提試劑盒、高分辨率瓊脂糖、PrimeScritp逆轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒、熒光定量qRT-PCR試劑盒，購(gòu)自大連寶生物公司；氯化鋰(LiCl)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞株、毒株、抗體

BHK-21細(xì)胞，BTV-1型毒株(Y863)、EHDV-1型毒株(V128/2014)與CHUV毒株(SZ/187)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；兔抗CHUV多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG熒光二抗，購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 監(jiān)控點(diǎn)與監(jiān)控動(dòng)物的設(shè)立

通過(guò)對(duì)云南、廣西、廣東牛、羊蟲(chóng)媒病毒的血清學(xué)調(diào)查并結(jié)合當(dāng)?shù)氐臍夂?、地理環(huán)境的分析，作者在我國(guó)的云南省師宗縣、廣西壯族自治區(qū)馬山市以及廣東省汕頭市郊區(qū)分別設(shè)定了三個(gè)牛、羊蟲(chóng)媒病毒監(jiān)控點(diǎn)。在監(jiān)控點(diǎn)設(shè)置BTV血清學(xué)陰性的牛和羊作為蟲(chóng)媒病毒監(jiān)控動(dòng)物，每年3至10月定期從監(jiān)控動(dòng)物上采血進(jìn)行蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)與分離工作。

1.4 血液樣品的采集與病毒分離

從監(jiān)控動(dòng)物上采集的肝素鈉抗凝血、EDTA抗凝血與常規(guī)血液三種血液樣品于4 ℃保存，并送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)與病毒分離工作。取200 μL EDTA抗凝血3 000 r·min-1離心10 min收集紅細(xì)胞(RBCs)，以PBS洗滌1次，加入1 mL滅菌水作用10 min裂解RBCs。取50 μL RBCs 裂解液以MagMax Express核酸自動(dòng)提取儀提取核酸，采用本實(shí)驗(yàn)室建立的牛羊蟲(chóng)媒病毒高通量Real Time qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行血液樣本中BTV、EHDV、PALV、阿卡斑病毒與牛流行熱病毒的核酸檢測(cè)。對(duì)qRT-PCR檢測(cè)為PALV陽(yáng)性的血液樣本(Ct值>38)，取200 μL RBCs裂解液接種長(zhǎng)為單層的BHK細(xì)胞并連續(xù)盲傳5代，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)時(shí)，收獲細(xì)胞上清，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)我們前期獲取的中國(guó)CHUV毒株(SZ/187與GX871)序列[17-18]以及GenBank公布的PALV毒株的序列，以PALV的群保守性Seg-7基因節(jié)段和血清型特異性Seg-2基因節(jié)段為靶序列，設(shè)計(jì)4對(duì)擴(kuò)增引物分別用于PALVSeg-7以及BCV、CHUV和DAV三種血清型Seg-2的特異性RT-PCR擴(kuò)增。引物由上海捷瑞公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1PALV的Seg-7與BCV、CHUV和DAV的Seg-2RT-PCR擴(kuò)增引物

Table1RT-PCRamplificationprimerstargetingSeg-7ofPALVandSeg-2ofBCV,CHUVandDAV

引物名Primersname引物序列(5'-3')Primerssequence位置Primerslocation產(chǎn)物大小/bpProductssizePALV-S7-FGCCAACTACACAACAAGAAAGSeg-7:171-191791PALV-S7-RCCGAATATAACAGTAAAGCCASeg-7:941-961BCV-S2-FGRGCTRTCATAGATTCGGAAGCSeg-2:987-10081251BCV-S2-RTACAAACYTTTACYAGAGCCATSeg-2:2215-2237CHUV-S2-FGGATTCACGCYATTACTCGGASeg-2:1175-11951004CHUV-S2-RATGGATTTCTTGTTGGGATTATSeg-2:2157-2178DAV-S2-FATTTTTCAACGAAGAGACGTGSeg-2:929-9491223DAV-S2-RATAGGAACACCTTTACCYAGGSeg-2:2131-2151

1.6 核酸提取、RT-PCR擴(kuò)增與測(cè)序

采用病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取病毒核酸， 94 ℃變性3 min后立即冰浴，進(jìn)行病毒dsRNA的解鏈。以變性后的核酸為模板，使用Radoms 6 mers引物和PrimeScritp逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成。取2 μL合成的cDNA為模板，以ExTaqDNA聚合酶進(jìn)行PALV的Seg-7與Seg-2的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)擴(kuò)增大小符合預(yù)期條帶進(jìn)行電泳膠回收與測(cè)序，使用Gontig Express軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接。將獲取的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)病毒的種屬與血清型進(jìn)行判定。

1.7 高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分析

將我國(guó)分離的BTV-1(Y863毒株)，EHDV-1(V128/2014毒株)、CHUV(SZ/187毒株)、DAV(V106/YN/2014毒株)與BCV(V104/YN/2014毒株)分別接種單層BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE后，離心收集細(xì)胞，使用RNAiso-Plus按說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。按文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行基因組dsRNA的純化。以高分辨率瓊脂糖配制2%濃度的凝膠，取10 μL純化后的病毒基因組dsRNA于4 ℃以90 V電壓電泳4～5 h，比較分析BTV、EHDV、CHUV、DAV和BCV五種病毒基因組dsRNA的電泳帶型。

1.8 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

從GenBank中下載分離自中國(guó)、日本、印度、澳大利亞與津巴布韋PALV毒株的Seg-2與Seg-7序列。使用Mega 6.0軟件[20]與本研究中獲取的序列進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果以軟件中的鄰近法(Neighbor-joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，選擇模型參數(shù)為：P-distanc，自舉檢驗(yàn)(Bootstrap)取值1 000。

1.9 免疫熒光試驗(yàn)

將CHUV(SZ/187毒株)、DAV(V106/YN/2014毒株)、BCV(V104/YN/2014毒株)分別接種12孔板BHK-21細(xì)胞，并設(shè)定未接毒空白細(xì)胞作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)72 h。待細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)CPE時(shí)，棄去培養(yǎng)液，以預(yù)冷的甲醇/丙酮混合液(1∶1)室溫固定20 min，PBST洗滌細(xì)胞一次；以5%的脫脂奶于37 ℃封閉1 h；棄去封閉液，加入200 μL兔抗CHUV多克隆抗體(1∶200稀釋)37 ℃孵育1 h，以PBST洗滌細(xì)胞三次；加入FITC標(biāo)記羊抗兔IgG熒光二抗200 μL(1∶400稀釋)37 ℃孵育1 h，以PBST洗滌細(xì)胞三次，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光。

1.10 病毒中和試驗(yàn)

選擇云南省分離的SZ/187毒株、V106/YN/2014毒株與V104/YN/2014毒株分別作為中國(guó)分離PALV的CHUV、DAV與BCV血清型參考毒株，進(jìn)行病毒的噬斑純化。將純化后的三個(gè)參考毒分別進(jìn)行10-1至10-7連續(xù)10倍稀釋，每個(gè)稀釋度按50 μL·孔-1的量，接種96孔板培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)6 d觀察CPE，采用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。將自然感染SZ/187、V106/YN/2014與V104/YN/2014三個(gè)毒株動(dòng)物的血清以56 ℃滅活30 min，并以1∶20～1∶640連續(xù)倍比稀釋備用。取50 μL 100 TCID50的參考毒病毒液，采用“固病毒-稀釋血清”的方法測(cè)定感染動(dòng)物血清的中和抗體效價(jià)；采用交叉保護(hù)中和試驗(yàn)分析CHUV、DAV與BCV陽(yáng)性血清之間是否存在交叉保護(hù)。

2 結(jié) 果

2.1 中國(guó)PALV毒株的分離

2012至2016年作者在我國(guó)云南省師宗縣、廣西壯族自治區(qū)馬山市以及廣東省汕頭市送檢的牛、羊血液樣品中，通過(guò)PALV的特異性Real Time qRT-PCR共計(jì)檢測(cè)出47份陽(yáng)性血液樣品。取PALV核酸陽(yáng)性血液以BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒的連續(xù)盲傳分離，在盲傳的第3～5代，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，表現(xiàn)為大量的貼壁細(xì)胞變圓與脫落(圖1)。本研究共計(jì)分離出19株P(guān)ALV，病毒分離信息見(jiàn)表2。

2.2 中國(guó)分離PALV Seg-7與Seg-2的擴(kuò)增與序列分析

對(duì)PALV的Seg7序列比對(duì)顯示，中國(guó)分離的19株P(guān)ALV的Seg-7核酸序列相似性在97.9%～100%，與中國(guó)臺(tái)灣分離毒株相似性在98.1%～99.1%，與日本分離毒株相似度在96%～97.4%，與印度分離毒株的相似度在93.9%～94.9%，與澳大利亞和津巴布韋分離毒株的相似性最低，在83.8%～90.5%。

對(duì)PALV的Seg2序列比對(duì)結(jié)果顯示，本研究分離的PALV分屬CHUV、DAV與BCV三種血清型(表2)。云南與廣西分離的13株CHUV的Seg-2核酸序列相似性在99%～100%，與日本分離CHUV毒株序列相似性在96.2%～98.3%。云南分離的3株DAV的Seg-2核酸序列相似性大于99.5%，與日本分離DAV毒株相似性在94.7%～98.4%，與澳大利亞和津巴布韋DAV毒株的相似性為91%。云南與廣東分離的4株BCV的Seg-2與日本分離BCV毒株核酸序列相似性均大于99%，與澳大利亞分離BCV毒株的相似性在91%～92.2%。

A. 感染細(xì)胞；B. 對(duì)照細(xì)胞A. Infected cells; B.Control cells圖1 PALV感染BHK-21細(xì)胞引起的CPEFig.1 CPE of BHK-21 cells caused by the infection of PALV

表22012至2016年我國(guó)分離PALV的分離信息

Table2IsolationinformationofChinesePALVform2012to2016

毒株號(hào)StrainNo.病毒/血清型Virus/serotype分離動(dòng)物Isolatedanimal分離時(shí)間Isolatedtime分離地點(diǎn)IsolatedsiteSZ/187PALV/CHUV13號(hào)牛2012年8月云南省師宗縣V144/YN/2012PALV/CHUV14號(hào)牛2012年9月云南省師宗縣GX871PALV/CHUV水牛2013年8月廣西壯族自治區(qū)馬山市V104/YN/2014PALV/BCV10號(hào)牛2014年10月云南省師宗縣V145/YN/2014BPALV/BCV/CHUV4號(hào)牛2014年9月云南省師宗縣V103/YN/2014PALV/CHUV5號(hào)牛2014年8月云南省師宗縣V101/YN/2014PALV/CHUV20號(hào)牛2014年8月云南省師宗縣V100/YN/2014PALV/CHUV4號(hào)羊2014年8月云南省師宗縣V099/YN/2014PALV/CHUV4號(hào)羊2014年8月云南省師宗縣V078/YN/2014PALV/CHUV20號(hào)牛2014年8月云南省師宗縣V098/YN/2014PALV/CHUV17號(hào)牛2014年9月云南省師宗縣V142/YN/2014PALV/CHUV19號(hào)牛2014年9月云南省師宗縣V106/YN/2014PALV/DAV4號(hào)牛2014年9月云南省師宗縣V141/YN/2014PALV/CHUV4號(hào)牛2014年9月云南省師宗縣V156/YN/2015APALV/CHUV水牛2015年8月云南省紅河州V157/YN/2015APALV/DAV水牛2015年8月云南省紅河州V256/GD/V2015PALV/BCV奶牛2015年11月廣東省汕頭市V203/YN/2016PALV/DAV牛2016年8月云南省師宗縣V252/GD/V2016PALV/BCV奶牛2016年1月廣東省汕頭市

A. V156/YN/2015與V157/YN/2015毒株分離自紅河州送檢血液樣品，而非監(jiān)控動(dòng)物；B. V145/YN/2014同時(shí)含有BCV與CHUV兩種血清型病毒

A. The V156/YN/2015 and V157/YN/2015 strains were isolated from blood samples of Red River State, not monitoring animals；B. V145/YN/2014 contains two serotype viruses of BCV and CHUV

2.3 中國(guó)分離PALV的dsRNA電泳分析

基因組核酸電泳可用于初步判斷基因組分節(jié)段dsRNA病毒的種類[20]。我們提取并純化了BTV、EHDV、CHUV、BCV、DAV五種病毒的基因組dsRNA，以2%的高分辨率瓊脂糖進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2顯示，PALV的CHUV、DAV、BCV三種血清病毒dsRNA型電泳帶型完全一致，呈現(xiàn)“3-3-4”的電泳帶型特征，而B(niǎo)TV和EHDV呈現(xiàn)出“3-3-3”的電泳帶型，與PALV基因組電泳帶型有著明顯的差異，這提示PALV的基因組節(jié)段大小與BTV和EHDV存在明顯差異，可通過(guò)核酸電泳“帶型”的差異對(duì)這三種病毒進(jìn)行快速區(qū)分。

1.BTV; 2.EHDV; 3.BCV; 4.CHUV; 5.DAV圖2 BTV、EHDV、BCV、CHUV、DAV基因組dsRNA高分辨率瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 The high-resolution agarose gel electrophoresis result of genomic dsRNA of BTV, EHDV, BCV, CHUV and DAV

2.4 中國(guó)分離PALV Seg-2與Seg-7的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析

不同血清型PALV的Seg-7顯示出明顯的地域特征(圖3)，可分為四簇：來(lái)自中國(guó)、日本與印度的不同血清型PALV共同形成一個(gè)大簇，我們將其命名為“Asia Group”，來(lái)自澳大利亞的PALV可形成兩個(gè)獨(dú)立的簇，分別命名為“Australia Group 1”與“Australia Group 2”，而來(lái)自非洲津巴布韋的PALV形成另一獨(dú)立的簇，命名為“Zimbabwe Group”。

不同血清型PLAV分離毒株Seg-2的分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖4)，中國(guó)CHUV、DAV、BCV三種血清毒株與日本、澳大利亞分離對(duì)應(yīng)血清型毒株聚為一簇。值得注意的是，在同一血清型毒株中，Seg-2的序列也體現(xiàn)出了一定的地域性，日本與中國(guó)分離毒株聚為緊密的一簇，而來(lái)自澳大利亞的毒株形成一個(gè)獨(dú)立于中國(guó)與日本毒株的分支。

2.5 中國(guó)分離BCV、CHUV與DAV毒株的免疫熒光分析

以實(shí)驗(yàn)室制備的兔抗CHUV陽(yáng)性血清為一抗，對(duì)感染了CHUV、BCV與DAV的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色分析。結(jié)果如圖5顯示，制備的CHUV陽(yáng)性血清可與病毒感染后細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，使BHK細(xì)胞顯現(xiàn)出特異性綠色熒光，而未感染病毒的對(duì)照細(xì)胞無(wú)熒光。

2.6 中國(guó)分離BCV、CHUV與DAV毒株的血清中和試驗(yàn)

自然感染SZ/187、V106/YN/2014與V104/YN/2014三個(gè)毒株的牛血清對(duì)100 個(gè)TCID50的CHUV、DAV與BCV病毒液的中和抗體效價(jià)均在1∶160以上，而1∶20稀釋的對(duì)照陰性血清對(duì)病毒液未產(chǎn)生中和作用，表明動(dòng)物發(fā)生了對(duì)應(yīng)血清型病毒的感染。交叉中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，CHUV、DAV與BCV三個(gè)血清型的中和抗體之間無(wú)交叉中和保護(hù)作用。

3 討 論

PALV廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，非洲的幾內(nèi)亞、尼日尼亞、津巴布韋，大洋洲的澳大利亞，亞洲的中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)、印度、日本、韓國(guó)均有該病毒的分離報(bào)道[1, 3-4, 8-9 ]。長(zhǎng)久以來(lái)，PALV在我國(guó)大陸地區(qū)的分布情況、與國(guó)外毒株之間的關(guān)系以及對(duì)動(dòng)物的危害等問(wèn)題一直不清楚。近10年來(lái)，由于全球氣溫升高等因素，新發(fā)和復(fù)發(fā)蟲(chóng)媒病毒病不斷出現(xiàn)，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[21]。為掌握我國(guó)牛、羊蟲(chóng)媒病毒的分布與流行特征，作者在我國(guó)的云南、廣西、廣東、湖北、江蘇、山西、新疆、內(nèi)蒙古等8個(gè)省建立了牛、羊蟲(chóng)媒病毒鑒定點(diǎn)并設(shè)定了監(jiān)控動(dòng)物。自2012年首次從云南省的監(jiān)控牛上分離出CHUV以來(lái)[17]，我們連續(xù)5年在云南、廣西與廣東省的監(jiān)控動(dòng)物上分離出PALV，表明該病毒很可能廣泛流行于我國(guó)南方地區(qū)。

我們從監(jiān)控動(dòng)物與送檢血液樣品中檢出47份PALV核酸陽(yáng)性血液樣品，然而將這些陽(yáng)性血液樣品在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)盲傳卻只分離出19株P(guān)ALV，仍有部分陽(yáng)性血液未能分離出病毒。我們認(rèn)為可能有兩方面的原因：(1)PALV陽(yáng)性血液在BHK細(xì)胞上盲傳可能不是PALV最佳的分離方式。我們分離的第一株P(guān)ALV(SZ/187)，通過(guò)將血液樣本在BHK-21細(xì)胞連續(xù)盲傳獲得成功分離，因此后繼大部分PALV的分離工作采用該方式進(jìn)行。王芳(F.Wang)等[18]采用C6/36盲傳1代而后繼續(xù)在BHK細(xì)胞連續(xù)盲傳的方式也從牛血液樣品中分離到了PALV毒株，提示PALV可以采用不同的方式進(jìn)行病毒分離，至于哪種分離方式對(duì)病毒分離效率最高，我們可以參考BTV的分離方式[22]進(jìn)行比較與摸索，從而提高PALV的分離效率。(2)當(dāng)感染動(dòng)物產(chǎn)生了感染病毒的中和抗體以后，血液中抗體與病毒的結(jié)合將導(dǎo)致病毒對(duì)接種細(xì)胞的感染能力大幅下降[22]。這可能是我們雖然檢測(cè)到PALV核酸陽(yáng)性，但病毒分離失敗的一個(gè)原因。通過(guò)PALV的動(dòng)物感染試驗(yàn)，分析在不同的時(shí)間點(diǎn)感染動(dòng)物血液中病毒核酸的水平、病毒中和抗體水平以及病毒成功進(jìn)行分離之間的關(guān)系，可幫助選擇最佳的時(shí)間點(diǎn)對(duì)監(jiān)控動(dòng)物進(jìn)行采血，有效開(kāi)展PALV的分離工作。

圖中●表示本研究中分離的PALV毒株及其他中國(guó)分離株● represents the isolated PALV strains in this study and other Chinese isolates圖3 鄰近法構(gòu)建的PALV Seg-7序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig 3 Phylogenetic analyses available Seg-7 of PALV with Neighbor-joining method

圖中●表示本研究中分離的PALV毒株● represents the isolated PALV strains in this study圖4 鄰近法構(gòu)建的PALV Seg-2系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)圖Fig 4 Phylogenetic analyses available Seg-2 of PALV with Neighbor-joining method

A. CHUV感染細(xì)胞；B.BCV感染細(xì)胞；C.DAV感染細(xì)胞；D.未感染BHK對(duì)照細(xì)胞A. CHUV infected cells; B.BCV infected cells; C.DAV infected cells; D. Uninfected BHK cells圖5 BHK-21細(xì)胞感染BCV、CHUV和DAV 72 h后的免疫熒光觀察結(jié)果Fig 5 Immunofluorescence result of BHK-21 cells after infected respectively with BCV, CHUV and DAV for 72 h

通過(guò)對(duì)PALV保守的Seg-7節(jié)段的測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該基因節(jié)段體現(xiàn)出了明顯的地域性。分離至中國(guó)、日本、印度三個(gè)國(guó)家的PALV聚為一個(gè)獨(dú)立的“Asia Group”，而分離自澳大利亞與非洲的PALV則形成了各自單獨(dú)的進(jìn)化簇。這一方面表明PALVSeg-7節(jié)段的核酸序列可作為不同血清型PALV地域性(Topotype)判定的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[15]，另一方面也提示中國(guó)、日本、印度三個(gè)國(guó)家的PALV有著最近的共有祖先。

對(duì)BTVSeg-2的系統(tǒng)發(fā)育分析表明[23-25]：不同血清型的BTV毒株可聚在一起形成一個(gè)基因型，并據(jù)此將BTV 27個(gè)血清型分為A～L等十二個(gè)基因型；在同一個(gè)BTV血清型中，還可根據(jù)毒株分離地域的不同進(jìn)一步分為“東方型”和“西方型”以及多個(gè)地域亞型。從本研究的結(jié)果來(lái)看，我們初步認(rèn)為同一血清型PALV的Seg-2在一定程度上也體現(xiàn)了地域型的差異，但由于世界范圍PLAV序列的缺乏，目前還難以確定PALV的Seg-2是否體現(xiàn)和BTV類似的進(jìn)化特征。隨著更多分離至亞洲、非洲與澳大利亞的不同血清型PALV毒株Seg-2的測(cè)序，將有助于我們從整體上進(jìn)一步認(rèn)知該病毒Seg-2與血清型之間的關(guān)系以及進(jìn)化特征。

PALVSeg-2與Seg-6編碼的VP2與VP5蛋白共同決定著病毒的血清型，激發(fā)感染動(dòng)物產(chǎn)生血清型特異性抗體，Seg-7編碼的VP7蛋白為PALV的群特異性抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血清群特異性抗體[3,11-13]。我們以制備的CHUV多克隆抗體對(duì)感染CHUV、BCV與DAV的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，雖然感染細(xì)胞都可產(chǎn)生特異性熒光，但CHUV的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于BCV與DAV。我們分析CHUV的陽(yáng)性血清中既含有針對(duì)VP7的群特異性抗體，也含有針對(duì)CHUV VP2與VP5的特異性抗體，因此免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示出CHUV感染細(xì)胞的免疫熒光信號(hào)強(qiáng)，而對(duì)BCV與DAV感染細(xì)胞的熒光信號(hào)相對(duì)較弱。血清中和試驗(yàn)顯示CHUV、DAV與BCV陽(yáng)性血清之間無(wú)交叉中和活性進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果提示獲取PALV VP7蛋白的單克隆抗體是研究PALV群特異性血清/抗原診斷檢測(cè)方法的首選[26]。

本研究報(bào)道了2012—2016年中國(guó)PALV的分離與Seg-2、Seg-7序列特征，并首次報(bào)道了PALV的DAV與BCV兩種血清型病毒在我國(guó)的分離。研究結(jié)果為我們進(jìn)一步開(kāi)展中國(guó)PALV的遺傳學(xué)特征、感染與致病性、診斷方法的研究提供了材料。在下一步的研究中，我們將進(jìn)行三方面的工作：(1)對(duì)中國(guó)分離的PALV代表毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲取中國(guó)分離CHUV、BCV與DAV代表毒株的遺傳背景，分析病毒的變異特點(diǎn)以及毒株之間的基因重配[16]。(2)純化出PALV病毒，建立PALV的血清學(xué)診斷方法，開(kāi)展血清學(xué)調(diào)查。(3)開(kāi)展不同血清型PALV毒株對(duì)牛羊等動(dòng)物的感染特性與致病性分析，特別是研究動(dòng)物發(fā)生多種血清型PALV感染或者與BTV混合感染時(shí)病毒的感染特性與致病性特點(diǎn)。

4 討 論

2012—2016年在云南、廣西、廣東監(jiān)控動(dòng)物牛、羊血液中共計(jì)分離出19株 PALV，表明PALV流行于我國(guó)南方地區(qū)。對(duì)分離株的Seg-2序列分析與BHK-21細(xì)胞上的交叉中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離毒株分屬Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)與Bunyip Creek virus(BCV)三種血清型，分別分離到13、3和4株，PALV三種不同血清型的抗體之間無(wú)交叉保護(hù)作用。對(duì)Seg-7序列分析顯示，該基因節(jié)段在不同血清型毒株間高度保守，基因序列的變異體出現(xiàn)明顯的地域特征。首次報(bào)道了DAV與BCV兩種血清型病毒在中國(guó)的分離。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] WHISTLER T, SWANEPOEL R, ERASMUS B J. Characterization of Palyam serogroup orbiviruses isolated in South Africa and serologic evidence for their widespread distribution in the country[J].EpidemiolInfect, 1989, 102(2): 317-324.

[2] 劉勝利, 黃冠勝, 趙增連, 等. 動(dòng)物蟲(chóng)媒病與檢驗(yàn)檢疫技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2011.

LIU S L, HUANG G S, ZHAO Z L, et al. Animal vector-borne diseases and inspection & quarantine technology[M]. Beijing: Sciences Press, 2011. (in Chinese)

[3] WHISTLER T, SWANEPOEL R. Characterization of potentially foetotropic Palyam serogroup orbiviruses isolated in Zimbabwe[J].JGenVirol, 1988, 69(Pt 9): 2221-2227.

[4] MIURA Y, GOTO Y, KUBO M, et al. Isolation of Chuzan virus, a new member of the Palyam subgroup of the genusOrbivirus, from cattle andCulicoidesoxystomain Japan[J].AmJVetRes, 1988, 49(12): 2022-2025.

[5] TATEYAMA S, YAMAGUCHI R, UCHIDA K, et al. An outbreak of congenital hydranencephaly and cerebellar hypoplasia among calves in South Kyushu, Japan: a pathological study[J].ResVetSci, 1990, 49(2): 127-131.

[6] KIM Y H, KWEON C H, TARK D S, et al. Development of inactivated trivalent vaccine for the teratogenic Aino, Akabane and Chuzan viruses[J].Biologicals, 2011, 39(3): 152-157.

[7] HECHINGER S, WERNIKE K, BEER M. Evaluating the protective efficacy of a trivalent vaccine containing Akabane virus, Aino virus and Chuzan virus against Schmallenberg virus infection[J].VetRes, 2013, 44: 114.

[8] LIM S I, KWEON C H, TARK D S, et al. Sero-survey on Aino, Akabane, Chuzan, bovine ephemeral fever and Japanese encephalitis virus of cattle and swine in Korea[J].JVetSci, 2007, 8(1): 45-49.

[9] KATO T, SHIRAFUJI H, TANAKA S, et al. Bovine arboviruses inCulicoidesbiting midges and sentinel cattle in southern Japan from 2003 to 2013[J].TransboundEmergDis, 2016, 63(6): e160-e172.

[10] OHASHI S, YOSHIDA K, YANASE T, et al. Analysis of intratypic variation evident in an Ibaraki virus strain and its epizootic hemorrhagic disease virus serogroup[J].JClinMicrobiol, 2002, 40(10): 3684-3688.

[11] STUART D I, GRIMES J M. Structural studies on orbivirus proteins and particles[J].CurrTopMicrobiolImmunol, 2006, 309: 221-244.

[12] YAMAKAWA M, FURUUCHI S, MINOBE Y. Molecular characterization of double-stranded RNA segments encoding the major capsid proteins of a Palyam serogroup orbivirus that caused an epizootic of congenital abnormalities in cattle[J].JGenVirol, 1999, 80(Pt 1): 205-208.

[13] YAMAKAWA M, KUBO M, FURUUCHI S. Molecular analysis of the genome of Chuzan virus, a member of the Palyam serogroup viruses, and its phylogenetic relationships to other orbiviruses[J].JGenVirol, 1999, 80(Pt 4): 937-941.

[14] WHISTLER T, SWANEPOEL R. Proteins of Palyam serogroup viruses[J].JGenVirol, 1990, 71(Pt 6): 1333-1338.

[15] YAMAKAWA M, OHASHI S, KANNO T, et al. Genetic diversity of RNA segments 5, 7 and 9 of the Palyam serogroup orbiviruses from Japan, Australia and Zimbabwe[J].VirusRes, 2000, 68(2): 145-153.

[16] OHASHI S, MATSUMORI Y, YANASE T, et al. Evidence of an antigenic shift among Palyam serogroup orbiviruses[J].JClinMicrobiol, 2004, 42(10): 4610-4614.

[17] YANG H, XIAO L, MENG J X, et al. Complete genome sequence of a Chuzan virus strain isolated for the first time in mainland China[J].ArchVirol, 2016, 161(4): 1073-1077.

[18] WANG F, LIN J, CHANG J T, et al. Isolation, complete genome sequencing, and phylogenetic analysis of the first Chuzan virus in China[J].VirusGenes, 2016, 52(1): 138-141.

[19] MAAN S, RAO S J, MAAN N S, et al. Rapid cDNA synthesis and sequencing techniques for the genetic study of bluetongue and other dsRNA viruses[J].JVirolMethods, 2007, 143(2): 132-139.

[20] TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].MolBiolEvol, 2013, 30(12): 2725-2729.

[21] SAEGERMAN C, BERKVENS D, MELLOR P S. Bluetongue epidemiology in the European Union[J].EmergInfectDis, 2008, 14(4): 539-544.

[22] CLAVIJO A, HECKERT R A, DULAC G C, et al. Isolation and identification of bluetongue virus[J].JVirolMethods, 2000, 87(1-2): 13-23.

[23] MAAN N S, MAAN S, BELAGANAHALLI M N, et al. Identification and differentiation of the twenty six bluetongue virus serotypes by RT-PCR amplification of the serotype-specific genome segment 2[J].PLoSOne, 2012, 7(2): e32601.

[24] MAAN S, MAAN N S, SAMUEL A R, et al. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes[J].JGenVirol, 2007, 88: 621-630.

[25] MACLACHLAN N J. Bluetongue: history, global epidemiology, and pathogenesis[J]PrevVetMed, 2011, 102(2): 107-111.

[26] YAMAKAWA M, FURUUCHI S. Expression and antigenic characterization of the major core protein VP7 of Chuzan virus, a member of the Palyam serogroup orbiviruses[J].VetMicrobiol, 2001, 83(4): 333-341.