基于離體培養(yǎng)酸棗種子萌發(fā)及幼苗生長對鹽脅迫的響應(yīng)研究

楊彥強，盧登洋，閆芬芬，張喬喬，吳翠云

塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，兵團南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工國家地方聯(lián)合工程實驗室，新疆阿拉爾 843300

近十余年，棗產(chǎn)業(yè)成為新疆農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。但新疆棗主要分布在環(huán)塔里木盆地的鹽堿土地中。因此鹽脅迫是制約新疆棗產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的重要因素。酸棗作為棗栽培的砧木，其耐鹽性強弱直接影響棗的產(chǎn)量和品質(zhì)。酸棗是異花授粉植物，利用種子繁殖后代性狀會廣泛分離，不同個體因基因型不同，其抗逆性表現(xiàn)有顯著差異。且植株個體因發(fā)育階段以及環(huán)境條件等因素的影響,在不同的生長條件下可能有不同的試驗結(jié)果。因此篩選耐鹽砧木成為解決這一問題的重要方法。目前國內(nèi)外對酸棗的研究主要集中在抗性差異方面[2-5]及利用根孽苗進行鹽堿脅迫篩選[6]。主要采用大田栽培、無土栽培等方法，此類方法因土壤或基質(zhì)的緩沖性和本身的差異性，可能增大試驗誤差。本研究擬通過離體培養(yǎng)方式，開展不同鹽濃度脅迫對酸棗種子萌發(fā)的影響研究，篩選耐鹽性酸棗單株，為耐鹽性酸棗砧木的篩選奠定基礎(chǔ)，進而解決新疆鹽堿土壤限制棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料是采集于山西省的野生成熟酸棗果實。自然陰干后,置室內(nèi)干藏，脫去果皮和種皮，取出種仁備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫條件下的酸棗種子萌發(fā)試驗

挑選飽滿無損傷的去核酸棗種仁，用鹽濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的水溶液浸泡12 h，無菌水沖洗2～3次，于無菌室內(nèi)75%酒精浸泡20 s，2%次氯酸鈉震蕩消毒20 min，1%次氯酸鈉震蕩12 min，無菌水沖洗2～3遍，剝?nèi)シN皮后分別接種于鹽濃度為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的MS培養(yǎng)基中，每處理接種30粒種子。接種后置于25±2℃、2500 Lx光照強度、14 h光照10 h黑暗條件下培養(yǎng)。接種后每天觀察記錄種子萌發(fā)數(shù)。并篩選離體培養(yǎng)條件下酸棗種子萌發(fā)的耐鹽性閾值。

1.2.2 酸棗離體培養(yǎng)幼苗的鹽脅迫試驗

1.2.2.1 酸棗離體培養(yǎng)幼苗的獲取

備用酸棗種仁用自來水浸泡12 h 后于接種室內(nèi)用無菌水沖洗2～3 次，75%酒精浸泡20 秒，2%次氯酸鈉震蕩消毒20 min，1%次氯酸鈉震蕩消毒處理12 min，再用無菌水沖洗2～3 遍，剝?nèi)シN皮后接種于MS 培養(yǎng)基，置于25±2℃、2 500 Lx光照強度、14 h 光照10 h 黑暗條件下培養(yǎng)，以獲取用于鹽脅迫處理的幼苗。

1.2.2.2 酸棗幼苗鹽脅迫試驗方案

待酸棗幼苗生長20 d后，將幼苗轉(zhuǎn)接到添加不同濃度NaCI 脅迫的MS 培養(yǎng)基中，鹽脅迫濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，每個處理17個單株。轉(zhuǎn)接后連續(xù)調(diào)查酸棗幼苗株高、葉片數(shù)、鹽害等級、死亡株數(shù)，計算株高增長變化、葉片增長變化、鹽害等級、死亡率，并確定離體培養(yǎng)酸棗幼苗的耐鹽性閾值（以死亡率超過50%為離體培養(yǎng)幼苗耐鹽閾值篩選標準）。

1.2.3 酸棗鹽敏感單株及耐鹽單株的篩選

根據(jù)篩選得到的離體培養(yǎng)酸棗幼苗的耐鹽性閾值，確定酸棗離體培養(yǎng)幼苗鹽敏感單株及耐鹽單株篩選的鹽濃度。每隔10 d觀察記錄植株生長變化情況及鹽害等級,從而確定酸棗離體培養(yǎng)幼苗鹽敏感單株及耐鹽單株的篩選所需鹽脅迫時間。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 種子萌發(fā)率的統(tǒng)計及耐鹽閾值的確定

于接種后第2 d開始逐日調(diào)查各處理酸棗種子萌發(fā)數(shù)( 以胚根長度超過種子長度的1/2為發(fā)芽標準），并計算萌發(fā)率、發(fā)芽勢、種子萌發(fā)耐鹽閾值。

萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%[7]。

發(fā)芽勢=發(fā)芽進程當日發(fā)芽最多種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

以脅迫發(fā)芽率比對照發(fā)芽率下降50%為標準計算耐鹽閾值[8]。

1.2.4.2 鹽害等級調(diào)查

每隔3～4 d 觀察幼苗變化，將幼苗從正常生長到幼苗死亡平均分為6個等級。

0級：植株正常

1級：葉片有輕微干枯焦黑卷曲

2級：葉片超過一半受害

3級：葉片超過75%受害或植株輕微萎蔫或側(cè)枝生長

4級：葉片脫落或植株頂端干枯或植株萎蔫

5級：植株死亡

1.2.4.3 幼苗葉片和株高測定

每隔3～4 d調(diào)查一次葉片數(shù)和株高（幼苗子葉至生長點的高度），計算幼苗葉和株高的增長量。葉片增長量以每次調(diào)查數(shù)量減去接種時初始葉片數(shù)，株高增長量以每次調(diào)查幼苗高度減去初始高度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel2010 軟件對調(diào)查數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，DPS方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率是衡量種子活力的最重要指標。由圖1可知，隨著鹽脅迫濃度的增加，離體培養(yǎng)酸棗種子的萌發(fā)率顯著降低，0.4%、0.6%、0.8%鹽濃度處理對酸棗種子萌發(fā)的抑制作用顯著高于CK 和0.2%，且種子開始萌發(fā)時間較CK 和0.2%處理延后2 d。各處理種子分別于接種后6～8 d停止發(fā)芽，最高萌發(fā)率依次為90.63%、71.43%、25.00%、21.21%、13.51%。發(fā)芽勢依次為50.0%、22.86%、10.71%、15.15%、5.41%。萌發(fā)率越小，說明酸棗種子受鹽脅迫抑制越重。以脅迫發(fā)芽率比對照發(fā)芽率下降50%為耐鹽閾值標準，說明0.4%的鹽濃度為酸棗離體培養(yǎng)種仁萌發(fā)的耐鹽閾值。

圖1 鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗種子萌發(fā)的影響（%）

2.2 不同濃度鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗幼苗株高變化的影響

由圖2可知，在鹽脅迫處理前8 d，離體培養(yǎng)酸棗幼苗株高增長量在各濃度處理間無顯著性差異，脅迫處理16 d之后，0.8%鹽濃度與CK和0.2%鹽濃度間有顯著差異，其他各處理間均無顯著性差異，脅迫第26 d 時，0.8%鹽濃度處理酸棗幼苗株高極顯著低于0.2%和CK（見表1）。各濃度幼苗株高變化的標準差隨脅迫時間的延長在整體上呈上升趨勢，說明脅迫時間越長，相同處理下，酸棗幼苗單株間株高變化差異越大，可能是因為酸棗幼苗個體基因型差異所致，不同個體的耐鹽性的強弱表現(xiàn)出差異性。

圖2 鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗株高變化的影響

表1 鹽脅迫條件下離體培養(yǎng)酸棗幼苗株高的變化（cm）

2.3 不同濃度鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗幼苗葉片生長的影響

由圖3可知，離體培養(yǎng)酸棗幼苗在不同鹽濃度脅迫下，幼苗葉片增長量均呈上升趨勢，0.2%鹽濃度條件下的酸棗幼苗葉片增長量在脅迫2～26 d 內(nèi)均高于其他各濃度。在脅迫26 d 時，CK酸棗葉片增長量分別是0.2%、0.4%、0.6%、0.8%鹽濃度的 0.82 倍、0.92 倍、1.12 倍、1.32 倍。但各濃度處理間均無顯著性差異。

圖3 鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗葉片變化的影響

2.4 不同濃度鹽脅迫對離體培養(yǎng)酸棗幼苗鹽害指數(shù)的影響

不同鹽濃度脅迫處理后酸棗幼苗鹽害指數(shù)變化情況見圖4，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的升高，酸棗幼苗鹽害指數(shù)逐漸上升。其中，0.6%和0.8%鹽濃度條件下，鹽害指數(shù)分別達84.71%和91.25%，指數(shù)變化值達到77.65%和88.75%，0.2%和0.4%濃度脅迫條件下鹽害指數(shù)變化分別為49.41%和54.67%，而對照條件下，酸棗幼苗的鹽害指數(shù)和指數(shù)變化分別為41.25%和40.00%。酸棗幼苗轉(zhuǎn)接到不同鹽脅迫濃度培養(yǎng)基，鹽脅迫前7 d，各處理的酸棗幼苗鹽害指數(shù)均表現(xiàn)為快速增高。脅迫7 d后，各濃度酸棗幼苗鹽害指數(shù)仍在升高，且鹽濃度越高增長越快。酸棗幼苗在脅迫21 d后各濃度幼苗鹽害指數(shù)出現(xiàn)明顯分離。0.6%和0.8%濃度處理酸棗幼苗鹽害指數(shù)顯著高于CK、0.2%、0.4%濃度處理。

圖4 鹽脅迫條件下離體培養(yǎng)酸棗幼苗鹽害指數(shù)變化

2.5 離體培養(yǎng)酸棗幼苗鹽敏感性和耐鹽性單株篩選

由表2可知，離體培養(yǎng)酸棗幼苗在不同鹽濃度脅迫45 d 內(nèi)幼苗的死亡率各濃度間具有較大差異。CK、0.2%鹽濃度酸棗幼苗在鹽脅迫下直到第45 d 幼苗死亡率均為0，而0.4%、0.6%、0.8%鹽濃度處理下幼苗出現(xiàn)死亡的時間依次為脅迫第40 d、第30 d、第25 d。0.6%鹽濃度酸棗幼苗在鹽脅迫第45 d 幼苗死亡率為52.94%。以死亡率超過50%為離體培養(yǎng)幼苗耐鹽閾值篩選標準，由此得出離體培養(yǎng)酸棗幼苗鹽脅迫閾值為0.6%。為更準確篩選出離體培養(yǎng)酸棗幼苗鹽敏感性和耐鹽性單株，因此確定在0.8%濃度鹽脅迫培養(yǎng)基中篩選耐鹽單株，在0.4%濃度鹽脅迫培養(yǎng)基中篩選敏感單株。

0.8%、0.4%鹽濃度下離體培養(yǎng)酸棗幼苗各等級所占比例見表3、表4。隨著脅迫時間的增加酸棗幼苗的鹽害程度越重。在0.8%鹽濃度脅迫時間在40～60 d內(nèi)，4級鹽害酸棗單株數(shù)量最多，分別為達40.46%、38.93%、40.46%，可將評價篩選耐鹽性酸棗幼苗的脅迫時間確定為40 d。本試驗在0.8%濃度脅迫培養(yǎng)基共轉(zhuǎn)接131株離體培養(yǎng)的酸棗幼苗，通過觀察記錄葉片變化、株高變化、生長情況和鹽害癥狀。在脅迫第42 d篩選出19株耐鹽單株。

酸棗幼苗在0.4%鹽濃度脅下，隨著脅迫時間的增加，4 級和5 級幼苗所占比例相應(yīng)增加。在0.4%鹽濃度脅迫下酸棗幼苗0 級株率均為0。敏感單株主要在第2 級和第3 級中篩選。酸棗幼苗在脅迫30 d時第2級株率大幅度減少而第3級株率開始減少。脅迫40 d后第4級和第5級所占株率開始快速增加?？蓪⒃u價篩選鹽敏感性酸棗幼苗的脅迫時間確定為30 d。本研究在0.4%濃度脅迫培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)接63株離體培養(yǎng)酸棗幼苗，通過觀察記錄葉片變化、株高變化、生長情況和鹽害癥狀。在脅迫第30 d篩選出6株鹽敏感單株。

表2 離體培養(yǎng)酸棗幼苗死亡率變化(%)

表3 0.8%鹽濃度下離體培養(yǎng)酸棗幼苗各等級所占比例（%）

表4 0.4%鹽濃度下離體培養(yǎng)酸棗幼苗各等級所占比例（%）

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

張國偉等[10]研究認為，地上部分、株高等指標可作為棉花苗期耐鹽的鑒定指標。本研究表明，不同鹽濃度的處理均會對離體培養(yǎng)酸棗幼苗的株高、葉片、鹽害等級和酸棗種子萌發(fā)產(chǎn)生影響，并隨著脅迫濃度的差異而變化。從圖2、圖3得出低濃度0.2%的鹽對酸棗的生長無抑制影響，且在酸棗幼苗的葉片增長和株高增長方面變化高于CK，說明酸棗生長需要一定濃度的Na+、CI-。這與陳陽春等的研究一致[11-12]。脅迫26 d,0.8%鹽濃度株高變化值與CK 相比有顯著差異，0.8%鹽濃度葉片變化值是CK 的49.39%。本研究證明，隨著鹽濃度升高，酸棗生長受到抑制，生物量大幅下降，這與劉國花的研究結(jié)論[13]一致，這是由于在鹽脅迫下，一些低濃度的營養(yǎng)元素供應(yīng)不足[14]。植株碳同化量減少、滲透調(diào)節(jié)能耗和維持生長能耗增加等原因，一般會使植株生長量和積累量減少[15]。在種子萌發(fā)試驗中，各脅迫濃度均抑制酸棗種子萌發(fā)，牛靈慧等[15]認為滲透效應(yīng)是指當基質(zhì)中鹽分含量增加時，滲透壓也隨之提高，水勢相應(yīng)降低，導(dǎo)致種子吸水困難，從而影響種子萌發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)不同鹽濃度脅迫條件下葉片變化各濃度間在脅迫期間均無顯著性差異。但由圖3可知，0.2%鹽濃度葉片變化值與0.8%濃度葉片變化值在脅迫16 d后出現(xiàn)明顯差異。同時，同處理各單株間同項指標差異較大?？赡茉蚴撬釛棡楫惢ㄊ诜壑参铮鞣N子因基因型不同，其抗逆性表現(xiàn)有顯著差異，在鹽脅迫條件下各單株表現(xiàn)具有顯著差異。因此，本研究通過篩選耐鹽單株及鹽敏感單株，預(yù)利用離體培養(yǎng)方法得到同基因酸棗耐鹽株系和鹽敏感株系，以減少因基因型差異而引起的試驗誤差，得到更準確的研究成果。

3.2 結(jié)論

不同鹽濃度脅迫對離體培養(yǎng)酸棗種子的萌發(fā)有顯著影響，接種2～4 d開始萌發(fā)，8 d后各處理發(fā)芽結(jié)束，但處理間開始萌發(fā)和結(jié)束萌發(fā)時間不同，CK、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%濃度處理下的最終萌發(fā)率分別為90.63%、71.43%、25.00%、21.21%、13.51%。離體培養(yǎng)酸棗種子萌發(fā)的耐鹽閾值為0.4%,而離體培養(yǎng)酸棗幼苗的耐鹽閾值為0.6%。結(jié)論與王志強[9]山西酸棗的耐鹽堿極限濃度是 0.6%結(jié)論一致。本研究共篩選出19株耐鹽單株和6株鹽敏感單株。