大豆異黃酮對大鼠肝臟脂肪酸代謝的影響

陳 蘋，李立科 ，陳曉林，李一帆，羅啟慧，2，黃 超，劉文濤，2，陳正禮，2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130）

肥胖是一種由脂肪代謝紊亂誘發(fā)的疾病，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)持續(xù)增加，全球超重和肥胖人數(shù)已達(dá)21億，肥胖已成為全球亟須解決的公共衛(wèi)生問題[1-2]。肥胖是由多種內(nèi)外因素共同作用導(dǎo)致的營養(yǎng)代謝障礙疾病，是多種并發(fā)癥的風(fēng)險因素。多項(xiàng)研究顯示，肥胖會增加糖尿病[3-4]、動脈粥樣硬化[5]、高血壓[6-7]等疾病的發(fā)病率。導(dǎo)致肥胖的原因包括能量攝入和輸出失衡、內(nèi)分泌紊亂、遺傳因素[8]以及人們生活方式和膳食的改變[9]。然而，肥胖及其相關(guān)疾病在亞洲國家發(fā)病率較低，這可能與亞洲國家飲食中含有較多的大豆以及大豆食物有關(guān)[10]。大豆異黃酮（soy isoflavone，SIF）是一種天然的植物雌激素，研究表明，大豆異黃酮具有多種生物學(xué)功能，例如改善血脂和血糖[11]、抗氧化[12]、增強(qiáng)免疫[13]等，從而對乳腺癌、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病等疾病發(fā)揮潛在的保護(hù)作用[10]。肝臟作為脂質(zhì)代謝的主要器官，具有合成、運(yùn)輸和氧化脂肪酸的功能，當(dāng)這些功能失常時就會導(dǎo)致脂肪酸累積最終形成肥胖。而與脂肪生成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP-1c）和脂解基因甘油三酯水解酶（ATGL）、乙酰輔酶A羧化酶α（ACC1）以及生脂基因脂肪酸合成酶（FAS）等對脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)代謝平衡發(fā)揮著重要作用。目前有關(guān)SIF對肥胖的降脂減重作用已有一定報道[11]，然而不同劑量的SIF是否會影響正常肝臟脂肪酸的代謝還鮮有報道，因此，本試驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測與肝臟脂肪酸代謝密切相關(guān)的基因，以期為SIF的干預(yù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物為40只6周齡SD雄性大鼠，體重（228.44±11.06）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，使用許可證SCXK（川）2015-030。

1.1.2 試驗(yàn)物品及試劑

試驗(yàn)大鼠專用飼料和墊料購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司；大豆異黃酮提取物購自西安天豐生物科技有限公司，產(chǎn)品批號NF-20140806，純度為90%；氯仿、異丙醇、無水乙醇購自成都科龍化工試劑廠，RNAiso-Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser、SYBRRPremix Ex TaqTMII購自大連寶生物工程有限公司

1.1.3 試驗(yàn)儀器

Leica石蠟切片機(jī)（德國徠卡有限公司），Leica冷凍切片機(jī)（德國徠卡有限公司），生物數(shù)碼顯微鏡（Nikon DS-Ril），大容量高速臺式冷凍離心機(jī)（ST16）（Thermo Scientific），熒光定量PCR 儀（CFX96 touch），移液槍（Thermo Scientific），等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動物處理

將40只大鼠隨機(jī)分為4組，在晝夜交替的自然光下飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。以課題組前期研究得到的劑量為依據(jù)并參照其動物處理方法[14]，將不同劑量（0，50，250，500 mg/kg）的大豆異黃酮溶于 0.5%羧甲基纖維素鈉中，每日各組大鼠按照2 mL/kg BW連續(xù)灌胃4 w，并記錄體重。試驗(yàn)中對動物的處置符合中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2.2 取材和切片

連續(xù)干預(yù)4 w后，利用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頸處死大鼠。迅速分離出肝臟并稱重記錄，臟器指數(shù)=肝臟（mg）/體重（g）。取部分肝臟組織凍存于液氮中，余下部分在4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。固定24 h后，將組織流水沖洗過夜，隨后依次梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片（5 μm）、烤片備用；另取組織利用30%蔗糖脫水過夜，冰凍切片（20 μm）備用。

1.2.3 HE染色

利用蘇木精-伊紅（HE）對切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)并記錄拍照。

1.2.4 油紅O染色

將新鮮配制的油紅O滴于組織上，室溫靜置20 min，60%異丙醇脫色，PBS潤洗后甘油明膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂滴并記錄拍照。

1.2.5 總RNA提取

在EP管中加入1 mL RNAiso-Plus，用組織勻漿器破碎組織后，室溫靜置5 min。隨后加入800 μL氯仿劇烈震蕩后，室溫靜置10 min，15 000 r/min 4℃離心15 min，取上清200 μL于EP管中，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，隨后15 000 r/min 4℃離心10 min，棄去液體后加入400 μL75%乙醇，室溫靜置5 min，隨后7 800 r/min 4℃離心5 min，棄去液體干燥后加入適量DEPC水溶解。

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄方法及具體步驟嚴(yán)格參考試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟見表1。

表1 去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Table 1 Eliminating the genomic DNA and reverse transcription system

上述反應(yīng)液混勻后，37℃反應(yīng)15 min，85℃5 sec，-20℃貯存。

1.2.7 引物設(shè)計

引物設(shè)計信息見表2，均由大連寶生物有限公司設(shè)計并合成。

1.2.8 Ct值采集

qPCR反應(yīng)體系為25μL：SYBR熒光染料12.5μL，cDNA 模板1 μL，上、下游引物各 1μL，無菌水 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5 min；95℃ 10 s，58℃30 s，72℃10 s，進(jìn)行30個循環(huán)，cDNA樣品設(shè)置3個重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的循環(huán)閾值（Ct）平均值，利用 2-ΔΔCt相對定量法計算相對表達(dá)量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（X±SD），P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮對大鼠體重的影響

由表3可知，在SIF干預(yù)前，各組大鼠體重?zé)o顯著差異；在SIF干預(yù)1 w后，各組大鼠體重雖有變化但差異不顯著；在SIF干預(yù)2 w后，高劑量組大鼠體重顯著（P＜0.05）低于對照組，其余各組差異不顯著；在SIF干預(yù)3 w后，中、高劑量組大鼠體重均顯著低于對照組，分別差異顯著（P＜0.05）和差異極顯著（P＜0.01）；在SIF干預(yù)4 w后，中、高劑量組大鼠體重均顯著低于對照組，差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 大豆異黃酮對大鼠生化指標(biāo)的影響

由表4可知，在SIF干預(yù)4周后，與對照組相比，低劑量組甘油三酯含量顯著下降（P＜0.05）；中劑量組總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量顯著下降（P＜0.05）；高劑量組甘油三酯和低密度脂蛋白含量極顯著下降（P＜0.01）。

2.3 大豆異黃酮對大鼠肝臟指數(shù)的影響

由表5可知，在SIF干預(yù)4周后，與對照組相比，各劑量組大鼠的肝臟指數(shù)均無顯著性差異。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Table 2 The sequences of real-time fluorescence quantitative PCR primers

表3 大豆異黃酮干預(yù)各時期大鼠體重Table 3 Body weight of rats at each period of administration of SIF g

表4 大豆異黃酮對大鼠生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of SIF on biochemical indicators of rats

表5 大豆異黃酮對大鼠肝臟指數(shù)的影響Table 5 Effects of SIF on liver index of rats

2.4 肝臟HE染色結(jié)果

如圖1所示，與對照組相比，SIF各劑量組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見異常病理變化。

2.5 肝臟油紅O染色結(jié)果

如圖2所示，與對照組相比，可見脂滴數(shù)量在低劑量組變化不明顯，而在中劑量和高劑量組明顯減少。

圖1 大鼠肝臟HE染色Figure 1 The liver HE staining of rats

圖2 大鼠肝臟油紅O染色Figure 2 The liver Oil Red O staining of rats

2.6 熒光定量PCR結(jié)果

如表6所示，與對照組相比，低劑量SIF干預(yù)4 w后，大鼠肝臟中FAS、ACC1 mRNA表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），SREBP-1C、PPARα 和 ATGL 表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）；與對照組相比，中、高劑量組FAS、SREBP-1C和ACC-1mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），而 PPARα 和 ATGL mRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01）。

3 討論

關(guān)于大豆異黃酮對動物體重的調(diào)節(jié)作用目前已有報道。Chen J.R.等[15]和 Huang C.等[16]研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮的劑量與體重呈負(fù)相關(guān)，表明其具有降脂減重的作用。在本試驗(yàn)中，灌胃中、高劑量的大豆異黃酮后能夠顯著的降低大鼠體重，并伴隨血清中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白濃度的降低。然而，在雄性斷乳大鼠[17]和ZDF大鼠[18]日糧中添加大豆異黃酮卻能夠顯著增加動物體重。這可能與大豆異黃酮的給藥途徑以及使用劑量有關(guān)，因?yàn)榇蠖巩慄S酮具有雌激素活性和抗雌激素活性雙重作用，其與雌二醇受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能主要取決于動物的生理狀態(tài)、給藥途徑、局部濃度以及內(nèi)源性雌激素水平等[19-20]。這些差異表明大豆異黃酮在哺乳動物中存在著不同的代謝機(jī)制。

表6 大鼠肝臟中目的基因mRNA的表達(dá)變化（n=10）Table 6 Changes in mRNA expression of target genes in liver of rats（n=10）

肝臟是哺乳動物的重要代謝器官，在脂肪合成、脂肪酸β氧化以及生酮過程中發(fā)揮了重要作用[21]。不同劑量的SIF是否會對肝臟產(chǎn)生病理損傷目前還不清楚，而在本試驗(yàn)中，大鼠經(jīng)口灌胃大豆異黃酮后，各劑量組之間肝臟指數(shù)和形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著變化，表明在此劑量范圍內(nèi)的SIF不會損傷肝臟的正常結(jié)構(gòu)。然而，中、高劑量的大豆異黃酮卻明顯減少了肝臟脂滴數(shù)量，這表明大豆異黃酮可以促進(jìn)大鼠肝臟脂滴的清除，從而減少脂滴的形成，這些結(jié)果與之前報道相一致[10]。SREBP-1c是脂肪細(xì)胞分化過程中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，ACC1、FAS基因是其下游靶位基因。ACC1和FAS是體內(nèi)脂肪酸合成的兩種關(guān)鍵酶，ACC1能夠催化乙酰輔酶A羧化為脂肪酸合成所必需的底物丙二酰輔酶A[22]，而FAS則是脂肪酸合成的限速酶，通過催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A進(jìn)而合成長鏈脂肪酸[23]。在大豆異黃酮干預(yù)后，SREBP-1c、ACC1和FAS的基因表達(dá)被顯著抑制，從而減少了脂肪酸的合成。PPARα是PPARs核激素受體超家族成員之一，它是肝臟中PPAR的主要形式，對體內(nèi)脂肪酸和膽固醇代謝、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)以及血漿載脂蛋白水平均有調(diào)控作用[24]。而ATGL是動物體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，能夠?qū)⒏视腿シ纸鉃楦视投ァ１驹囼?yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)中、高劑量的大豆異黃酮干預(yù)后，PPARα和ATGL基因表達(dá)顯著增加，激活的PPARα可促進(jìn)膽固醇向膽酸的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)脂蛋白代謝，降低膽固醇水平。同時，過度表達(dá)的ATGL可加速脂肪的分解，降低脂肪的沉積。

綜上，SIF可通過抑制肝臟SREBP-1c、ACC1和FAS基因，增強(qiáng)PPARα和ATGL基因，進(jìn)而減少肝臟脂肪酸的合成，加速脂肪的分解。然而，SIF作為一種食用保健品，對于肥胖人群具有相對較好的降脂減重作用，但過量攝入SIF則可能會影響到正常肝臟脂肪酸的代謝，導(dǎo)致潛在的健康風(fēng)險。

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