豬乙型腦炎病毒基因Ⅰ型弱毒株免疫小鼠后誘導(dǎo)INF-γ的能力

王 僑，柴春霞，馮 瑤，曹鈺瑩，鄧?yán)钏?，曹三杰，黃小波，文翼平，趙 勤，伍 銳

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130）

干擾素（IFN）是由干擾素誘生劑誘導(dǎo)生物細(xì)胞產(chǎn)生的高活性多功能糖蛋白，是多功能細(xì)胞因子家族中的成員。根據(jù)免疫原性和分子結(jié)構(gòu)的不同，可將干擾素分為α、β、γ，3種類型，其中每種類型根據(jù)組成的氨基酸差異又可分為多個(gè)亞型，不同亞型間有生物活性上的差異[1]。INF-γ是典型的Ⅱ型免疫干擾素，由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在評價(jià)疫苗的免疫原性和保護(hù)率時(shí)幾乎都要檢測INF-γ的水平，足以見INF-γ水平的高低在免疫中的重要作用[2-4]。INF-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞MHCⅡ類分子和協(xié)同刺激分子的表達(dá)，提高抗原遞呈能力，誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答，在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒感染等方面起著非常重要的作用[5-6]。

日本乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）是一種經(jīng)蚊媒傳播的人畜共患病，病原體是日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）。母豬感染JEV主要引起繁殖障礙、公豬感染JEV主要引起睪丸炎[7-8]。乙腦只有一個(gè)血清型，不同的基因型有交叉保護(hù)，根據(jù)E基因核苷酸序列的差異，可以將JEV分為5個(gè)基因型（基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型以及Ⅴ型）[9]。早在1990年，Chen W.R.[10]等通過對從亞洲不同地區(qū)分離的46株乙腦病毒的PrM基因的核苷酸序列進(jìn)行研究和分析，發(fā)現(xiàn)它們出現(xiàn)12%的基因差異，因此將這12%的差異度作為乙腦病毒基因分型的分界值。目前使用的豬乙腦減毒活疫苗是SA14-14-2株，該毒株屬于基因Ⅲ型。在基因Ⅲ型和Ⅰ型都為主要流行基因型的現(xiàn)在，開發(fā)基因Ⅰ型的乙腦減毒活疫苗是有前景的[11-15]。本研究以實(shí)驗(yàn)室傳代致弱的基因Ⅰ型的豬乙型腦炎病毒SCYA201201株的弱毒苗F122代次為研究對象，采用弱毒株腹腔免疫小鼠后測定INF-γ的水平。評估F122作為候選疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生INF-γ的水平。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)毒株

豬日本腦炎病毒SCYA201201株（Genbank：KM658163，與基因Ⅲ型毒株相似性為88.48%）的傳代致弱株（F122代）和乙型腦炎強(qiáng)毒株SC2013（LD50=102.2），由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心保存。

1.2 細(xì)胞系與試驗(yàn)動(dòng)物

BHK-21細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心凍存；昆明小鼠購買于四川成都達(dá)碩有限公司。

1.3 主要試劑

胰酶、DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，USA）、青鏈霉素雙抗、卡那霉素、細(xì)胞生長液（含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基）、細(xì)胞維持液（含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基）、INF-γ ELISA 檢測試劑盒（NEO，China）。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)和JEV病毒的傳代

取出液氮中凍存的BHK-21細(xì)胞，放置于37℃恒溫水浴鍋中，快速晃動(dòng)使細(xì)胞在1 min內(nèi)融化，再將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min。重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中，加入7 mL維持液，放置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑選長勢良好的單層致密的BHK-21細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌兩次后，加入1 mL PBS和100 μL胰蛋白酶進(jìn)行消化，待大部分細(xì)胞從壁上脫落，加入2 mL含有小牛血清的DMEM細(xì)胞生長液終止消化，用移液管將貼壁細(xì)胞反復(fù)吹打后移至5 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，用1 mL細(xì)胞生長液重懸，移至裝有6 mL生長液的細(xì)胞瓶中，搖勻，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

挑選單層致密的BHK-21細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌兩次后，接種SCYA201201株病毒液0.4 mL，37℃孵育，孵育期間每15 min搖晃一下，1 h后倒掉病毒液，加入6 mL維持液，放置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞出現(xiàn)病變情況。待細(xì)胞出現(xiàn)80%～90%的病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融反復(fù)3次，移液管反復(fù)吹打后移至50 mL離心管中，4℃，8 000 r/min，離心10 min，吸取上清，用0.22 μm的濾器過濾，濾過后作為病毒液，標(biāo)記為F1。以F1為第一代病毒原液，繼續(xù)接種到BHK-21細(xì)胞上，收獲的病毒液為第二代，記為F2。按上述方法將病毒液在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代至122代，記為F122。

1.5 JEV病毒滴度的測定

使用DMEM維持液將F122代病毒液按照10倍梯度稀釋，稀釋后將不同梯度的病毒液接種于長滿BHK-21細(xì)胞的6孔板中，每孔0.2 mL，并設(shè)置1孔對照組，37℃孵育1.5 h后每孔加入2 mL 1%的甲基纖維素維持液，放置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，待細(xì)胞出現(xiàn)蝕斑后，用1%結(jié)晶紫染色（15～20 min），根據(jù)蝕斑形成數(shù)量，計(jì)算出病毒的滴度（PFU/mL）。

1.6 免疫早期誘導(dǎo)的小鼠干擾素γ水平

1.6.1 小鼠免疫以及樣本采集

24只3周齡的昆明小鼠隨機(jī)分為2組，每組12只，分別免疫JEV弱毒株F122和PBS。免疫方式為腹腔注射，劑量為0.3 mL/只（含病毒量為3×106PFU），在免疫后的 6、12、18、24 h 采集 3 只小鼠血液。

1.6.2 免疫早期小鼠血清中INF-γ的含量

采集不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠血液，離心分離出血清，使用INF-γ ELISA試劑盒按照操作說明檢測各組小鼠的干擾素水平。

1.7 免疫兩周后小鼠INF-γ的水平

1.7.1 小鼠血清中干擾素含量的檢測

上一步驟中免疫后的兩組小鼠，免疫后第二周采集各組小鼠血液分離出血清，使用ELISA試劑盒（NEO，China）按照操作步驟測定各組小鼠血清中的INF-γ的水平。

1.7.2 小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中干擾素含量的檢測

采集血液后的兩組小鼠各隨機(jī)挑選3只，無菌提取脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)至2×105個(gè)/mL，每孔200 μL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組加入100 PFU/mL的病毒液，陽性對照組加入終濃度為5 μg/mL的ConA刀豆蛋白A，陰性對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液，分別去誘導(dǎo)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞分泌INF-γ，處理好之后將96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。捕捉各組淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測INF-γ水平。

1.8 小鼠免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

將提取淋巴細(xì)胞后，對兩組剩下的10只小鼠，采用75LD50的豬乙型腦炎病毒強(qiáng)毒株SC2013進(jìn)行攻毒，攻毒后連續(xù)觀察小鼠14 d，記錄小鼠存活情況。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，比較顯著性差異。使用GraphPad Prism6.0軟件和excel軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 JEV的細(xì)胞接種及病毒滴度測定

從圖1中我們可以看出，正常的BHK-21細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形（圖1a），接種了JEV后細(xì)胞破裂（圖1b），漂浮在細(xì)胞瓶中，圖1c是蝕斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋10-5倍后形成的蝕斑個(gè)數(shù)為20個(gè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)后的蝕斑數(shù)計(jì)算JEV病毒的滴度為107.0PFU/mL。

2.2 JEV感染小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的早期干擾素水平

根據(jù)INF-γ檢測試劑盒操作說明，測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在OD450nm處的吸光值，根據(jù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)的OD450nm值，描繪出INF-γ的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），對照標(biāo)準(zhǔn)曲線后實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠免疫JEV F122代弱毒株后，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生INF-γ。小鼠體內(nèi)的INF-γ水平在免疫6h后上升到一個(gè)較高水平（OD450nm=0.250），12 h后出現(xiàn)下降（OD450nm=0.128），18 h和12 h時(shí)接近，免疫24 h后再次上升（OD450nm=0.215）。

圖2 INF-γ含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 INF-γ Content standard curve

圖3 JEV感染小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的在24 h內(nèi)的干擾素水平Figure 3 Interferon levels induced by JEV in mice after immunization within 24 h

2.3 JEV免疫小鼠14 d后干擾素水平

2.3.1 血清中的干擾素水平

從圖4結(jié)果中可以觀察到，免疫14 d后JEV組血清中的INF-γ水平高于PBS組（P＜0.05），并且差異顯著。

2.3.2 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的干擾素水平

PBS組誘導(dǎo)前后INF-γ水平變化不大（OD450nm=0.093），F(xiàn)122 組誘導(dǎo)前 （OD450nm=0.108） 和誘導(dǎo)后（OD450nm=0.123）水平變化顯著（P＜0.05）。

2.4 小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

攻毒后，連續(xù)觀察小鼠14 d，記錄死亡率并描繪生存曲線（圖6）。結(jié)果顯示對照組10只全部死亡，而免疫JEV F122代弱毒株的小鼠只死亡3只，保護(hù)率為70%。

圖4 免疫14 d后血清中的干擾素水平Figure 4 Levels of interferon in serum after immunization with 14 d

圖5 免疫14 d后淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的干擾素水平Figure 5 Levels of interferon in lymphocyte culture supernatant after immunization with 14 d

圖6 小鼠生存曲線Figure 6 Survival curve of mice

3 討論與結(jié)論

干擾素γ（IFN-γ）是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，能夠通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)機(jī)體的免疫反應(yīng)。IFN-γ主要通過與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)而發(fā)揮抗病毒作用，IFN-γ除具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[14]。

豬源乙型腦炎病毒（SCYA201201株），于2012年8月從四川雅安某豬場流產(chǎn)胎兒腦組織分離鑒定[15]。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病中心采用細(xì)胞上連續(xù)傳代致弱的方法將SCYA201201株傳至122代次[16-17]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠接種弱毒株F122后，在6、12、18、24 h這4個(gè)早期時(shí)間點(diǎn)的血液中IFN-γ水平均高于空白組，尤其是在6 h和24 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IFN-γ水平顯著高于空白組，我們推測我們免疫12 h后產(chǎn)生的INF-γ與JEV弱毒株作用，導(dǎo)致INF-γ水平下降，直到18 h后，機(jī)體免疫刺激增強(qiáng)，INF-γ水平逐漸回升。實(shí)驗(yàn)說明JEV弱毒株F122代免疫小鼠后，可以在早期誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的INF-γ對抗病毒感染。

免疫兩周后小鼠血液和淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平仍然高于空白組，并且接近于免疫早期12 h和18 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，這說明F122弱毒株免疫小鼠后可以誘發(fā)小鼠產(chǎn)生INF-γ，并且在體內(nèi)維持超過兩周的時(shí)間。我們結(jié)合小鼠攻毒保護(hù)的結(jié)果，以及前言中提及的INF-γ對于免疫的重要性。進(jìn)一步說明JEV弱毒株F122代具有作為候選疫苗刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生INF-γ的潛力，為豬乙型腦炎病毒基因Ⅰ型弱毒苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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