癢螨病患兔皮損中細胞因子IFN-γ、IL-4和轉錄因子T-bet、GATA-3 的表達

廖曉霞，趙習彬，賴為民，謝 躍，楊光友，古小彬

（四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130）

兔癢螨病是由綿羊癢螨（兔亞種）（Psoroptes ovis var.cuniculi）寄生于兔的外耳道皮膚表面引起的一種慢性侵襲性傳染性皮膚病[1]。該病以螨蟲抗原物質引起的過敏反應為特征，引起宿主皮膚表面滲出和炎癥、皮膚肥厚、瘙癢劇烈，使得皮膚嚴重損傷形成結痂，導致宿主體重下降，甚至造成死亡。

寄生蟲感染宿主后，宿主皮膚會發(fā)生T淋巴細胞的浸潤，其中輔助性T淋巴細胞（helper T cell，Th）處于核心位置，其可分為Th1、Th2、Treg和Th17等不同亞型細胞。其中Th1/Th2細胞平衡是維持正常細胞免疫和體液免疫所必需的，平衡失調則可能導致異常的免疫應答。γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和白介素 4（interleukin 4，IL-4）分別是 Th1 和 Th2細胞的特征細胞因子[2]；同時，T細胞表達的T盒（T box expressed in T cells，T-bet）和 GATA 連接蛋白-3（GATA binding protein-3，GATA-3）分別是 Th1 和Th2細胞的特征轉錄因子[3]。有關研究認為，轉錄因子T-bet和GATA-3蛋白水平的變化可以間接反映Th1/Th2細胞在體內的數量的動態(tài)變化及Th1/Th2細胞因子的表達水平[3-4]。同時，細胞因子IFN-γ及IL-4可通過雙向正反饋環(huán)，調控特異性轉錄因子T-bet與 GATA-3 的表達[2]。

疥螨病在內的傳染性疾病均提示與調節(jié)性T細胞或輔助性T細胞分化的Th1、Th2和Th17有關[5]；綿羊感染綿羊癢螨的24 h內表現(xiàn)出朝向Th2免疫應答的趨勢[6-8]。本文旨在探討IFN-γ、IL-4與T-bet、GATA-3在不同病變程度的癢螨病患兔皮損組織中的表達。

1 材料和方法

1.1 試驗動物準備

購買80～100日齡、體重2.0～3.0 kg的健康新西蘭兔30只，隨機選擇其中22只新西蘭兔同時進行人工感染綿羊癢螨（兔亞種）[9]，剩下的8只新西蘭兔作為陰性對照組。每只新西蘭兔飼養(yǎng)在單獨的籠子里，并且自由獲取食物和飲水，當耳部癢螨感染病變評分達到1分、3分和5分（參照F.Guillot等[10]描述的評分標準）時，待用。

F.Guillot和 F.Wright的評分系統(tǒng)[10]：0 分，沒有結痂和螨蟲；1分，耳道有少數結痂，有活癢螨；3分，耳道和1/4的耳郭存在結痂，有活癢螨；5分，耳道和3/4的耳郭存在結痂，有活癢螨。

1.2 耳部樣品采集

隨機選擇1.1中耳部病變達到1分、3分和5分的患兔各5只，作為患病組；選用5只健康新西蘭兔作為對照組（健康組/0分組）。具體組織樣品采集過程為：新西蘭兔稱重后，注射適宜的氯胺酮（1～2 mg/kg·W）進行麻醉，頸動脈放血處死后，用鑷子將耳部痂皮盡可能去除，用直徑為7 mm的環(huán)形皮膚采樣器采集患兔耳部皮損組織和健康兔同等位置的皮膚組織。一部分皮膚固定于4%多聚甲醛-0.1%磷酸鹽緩沖液固定液中，另一部分皮膚保存于液氮中，待用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定

取1.2中存于液氮中的約100 mg的耳部皮損組織置于組織研磨器中，加入0.9mL的PBS（0.01 mol/L，pH=7.4），研磨呈勻漿4℃下3000r/min離心10min，上清移入新的1.5 mL EP管中，-70℃凍存?zhèn)溆?。按照IFN-γ、IL-4 ELISA檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）檢測皮膚組織勻漿中IFN-γ、IL-4的含量。結果用每毫克皮膚組織中有多少皮克細胞因子來表示（pg/mg）。

1.4 免疫組織化學

1.4.1 免疫組織化學染色

取1.2中存于4%多聚甲醛-0.1%磷酸鹽緩沖液中的耳部皮膚組織，按照常規(guī)方法進行石蠟包埋切片[11]。隨后進行免疫組化染色，具體步驟如下：5 μm切片脫蠟至水后在95℃的0.01 mol/L（pH 6.0）枸櫞酸緩沖液和0.5 mol/L（pH 8.0）EDTA緩沖液中分別進行T-bet和GATA-3抗原的修復，隨后將切片放在3%H2O2溶液中25 min后用0.01 mol/mL PBS洗滌；滴加5%BSA封閉液室溫下放置40 min后，滴加相應以1∶100稀釋的一抗（鼠T-bet IgG多克隆抗體，ab-91109，英國Abcam公司；山羊GATA-3 IgG單克隆抗體，sc-22206，美國Santa-Cruz公司）于4℃冰箱內過夜，37℃保溫1 h后PBS沖洗。隨后滴加相應以1∶100稀釋的生物素二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG，驢抗山羊IgG；武漢博士德生物工程有限公司）于37℃下放置1 h后PBS洗滌；滴加試劑SABC于37℃下放置1 h后PBS洗滌，使用DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）進行顯色，并進行復染，最后通過Nikon DS-U2/L2 Controler成像系統(tǒng)和 NIS-Elements F 3.22成像軟件（Nikon）進行拍照。

1.4.2 結果判定及分析

陽性結果以陽性細胞和細胞著色強度進行綜合判定，結果利用半定量法[12-13]進行分析。每個樣本隨機選擇5個區(qū)域進行觀察，利用Image-Pro plus軟件計數至少200個細胞。半定量法分析陽性細胞所占百分率和單個細胞染色強度。①陽性細胞所占百分率（R=陽性細胞數在每個所選區(qū)域所占比例）評分：R≤5%記為0分；5%＜R≤25%記為1分；25%＜R≤50%記為2分；50%＜R≤75%記為3分；R≥75%記為4分。②染色強度評分：細胞無染色記為0分；細胞弱染色記為1分；細胞中度染色記為2分；細胞強染色記為3分。綜合陽性細胞所占百分率評分和陽性細胞染色強度評分來得到樣本的最終結果：0分記為-；1～3分記為+；4～5分記為++；5分以上記為+++。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 總RNA提取與反轉錄

使用動物組織總RNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）提取總RNA，并進行RNA完整性、純度及濃度的檢測。隨后使用cDNA合成試劑盒（美國Thermo Fisher科技公司）進行反轉錄合成cDNA，保存于-70℃待用。

1.5.2 引物設計

根據 GenBank 中家兔 IL-4（DQ852343）、IFN-γ（AB010386）、GATA-3（XM008268070）、T-bet、（XM 008271373）、GAPDH（L23961）的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（見表1），由上海英濰捷基有限公司合成。

表1 IL-4、IFN-γ、GATA-3、T-bet、GAPDH 基因的引物序列Table 1 Primers sequences of IL-4、IFN-γ、GATA-3、T-bet、GAPDH genes

1.5.3 實時熒光定量PCR總反應

本試驗采用SYBR染料法實時熒光定量PCR檢測相關基因表達水平，同時以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）進行校正?？偡磻w系20 μL：含SYBR Green Supermix 10μL，上下游引物10μmol/mL各0.4μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 7.2 μL。瞬時離心后，放入 Bio-Rad熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR反應。每個反應設置3個重復孔，和空白對照即將模板cDNA換為等體積的ddH2O。循環(huán)設置（兩步法）：95℃1 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s（GAPDH/IL-4/T-bet退火溫度為62℃，IFN-γ/GATA-3退火溫度為65℃），循環(huán)40次；于95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s得融解曲線。反應完成后，即得到所有標本的所有記錄點曲線。使用軟件對數據進行自動分析，調整基線后，計算達到閾值的最低循環(huán)數（Ct值）。標本中的目的基因的mRNA拷貝數以Ct值來計算，并且每個基因測量均重復3次。

1.6 數據分析

IFN-γ、IL-4蛋白水平結果用平均值±標準差（mean±SD）表示，并用GraphPad prism 6.0進行統(tǒng)計分析和作圖；免疫組化所得數據通過Fisher精確檢驗分析患病組（1分組，3分組，5分組）與健康組（0分組）間的差異顯著性；熒光定量PCR所得數據通過Rest 2009和GraphPad prism 6.0軟件進行分析和作圖。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 IFN-γ和IL-4蛋白的表達

IL-4蛋白的量從0分組的（0.135±0.003 63）pg/mg增加至 1 分組的（0.148 8±0.014 26）pg/mg，隨后減少至 3 分組的（0.131 6±0.006 22）pg/mg，并進一步再減少至5分組的（0.117 2±0.003 49）pg/mg；患病組（1分組、3分組和5分組）皮損中IL-4蛋白較0分組均無明顯差異（P＞0.05）（見圖 1a）。

從圖 1b可發(fā)現(xiàn)，與 0分組（0.344 2±0.014 33）pg/mg相比，3分組皮損中的IFN-γ蛋白呈顯著性增加（0.463 6±0.014 95）pg/mg，P＜0.05，但 1 分組（0.366 4±0.025 26）pg/mg和 5 分組（0.3482±0.04131）pg/mg的 IFN-γ蛋白增加不顯著（P＞0.05）。

圖1 在不同病變評分的癢螨病皮損組織中IL-4和IFN-γ蛋白的表達Figure 1 Expression of IL-4 and IFN-γ proteins in the different psoroptic mange lesion scores

2.2 GATA-3和T-bet蛋白的表達

免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)GATA-3和T-bet的陽性反應產物均定位于細胞核。如圖2a所示（紅色箭頭所指），GATA-3蛋白的陽性產物在0分組和1分組的細胞核上有所表達，而在3分組和5分組有很少且弱的表達；患病組（1分組、3分組和5分組）皮損處GATA-3蛋白較0分組均無明顯差異（P＞0.05）（見表2）。此外，如圖2b所示（黑色箭頭所指），T-bet蛋白的陽性產物在患病組（1分組、3分組和5分組）的細胞核中均有所表達，但患病組（1分組、3分組和5分組）皮損中T-bet蛋白較0分組均無明顯差異（P＞0.05）（見表 2）。

2.3 IFN-γ、IL-4、T-bet和 GATA-3 mRNA 的表達

從圖3可知，患病組（1分組、3分組和5分組）皮損中的IL-4 mRNA較0分組均無明顯差異（相對表達倍數：1分組/0分組=1.808，3分組/0分組=1.849，5 分組/0 分組=0.808；P＞0.05）。與 0 分組相比，3分組皮損中的IFN-γ mRNA呈顯著性增加（3分組/0分組=2.365，P＜0.05），而1分組和5分組皮損中的IFN-γ mRNA均無明顯差異（1分組/0分組=1.505，5 分組/0 分組=1.493；P＞0.05）。

患病組（3分組和5分組）皮損中的GATA-3 mRNA較0分組均顯著性減少（3分組/0分組=0.510，5分組/0分組=0.453；P＜0.05），而 1 分組皮損中GATA-3 mRNA差異不顯著（1分組/0分組=0.553，P＞0.05）；1 分組和 3 分組皮損中的 T-bet mRNA較0分組均顯著性增加（1分組/0分組=6.322，3分組/0分組=4.767；P＞0.05），而 5 分組皮損中的T-bet mRNA差異不顯著（5分組/0分組=3.515，P＞0.05）。

表2 在不同病變評分的癢螨病皮損中GATA-3和T-bet蛋白表達的比較Table 2 Comparison of GATA-3 and T-bet protein expression in the different psoroptic mange lesion scores

圖2 癢螨病皮損組織中GATA-3蛋白和T-bet蛋白的表達及定位（×200）Figure 2 The expression and location of GATA-3 protein and T-bet protein in lesion of psoroptic mange（×200）

圖 3 不同病變評分的癢螨病皮損中IL-4、IFN-γ、GATA-3、T-bet mRNA的相對表達倍數。Figure 3 The relative expression of IL-4、IFN-γ、GATA-3 and T-bet mRNA levels in the different psoroptic mange lesion scores

3 討論

癢螨感染宿主后會引起宿主寄生部位皮膚發(fā)生炎性細胞的浸潤，主要以嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞[14-17]浸潤為主；而浸潤的淋巴細胞則主要以T淋巴細胞為主[16]。其中Th細胞處于核心位置，其可分為Th1、Th2、Treg和Th17等不同亞型細胞。Th1/Th2細胞平衡是維持正常細胞免疫和體液免疫所必需的，平衡失調則可能導致異常的免疫應答。Th1細胞可通過IFN-γ和腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）的產生發(fā)揮促進炎癥反應的作用，如果不加以控制，可能會導致組織的損傷和免疫病理學的發(fā)生；相反地，由Th2細胞產生的細胞因子如IL-4和IL-13則具有抗炎的作用，可預防疾病并緩解病情[18]。T-bet和GATA-3的相對表達會導致Th1/Th2的失衡，在一些免疫相關的疾病中均得到體現(xiàn)，如炎癥性腸道疾病、哮喘、類風濕性關節(jié)炎和特異性皮炎[19-21]。然而，沒有任何研究報道過在不同病變評分的癢螨病中這些細胞因子和轉錄因子的表達情況。因此，本部分檢測了不同病變程度的癢螨病患兔耳部皮損中Th1/Th2主要的細胞因子和轉錄因子的表達，為進一步了解癢螨病的發(fā)病機制提供重要的依據，亦為尋求新的癢螨病防治措施奠定基礎。

癢螨病感染的早期階段已證實與Th2免疫反應有關，研究發(fā)現(xiàn)癢螨的早期感染過程中會有γδ T細胞和CD4+T細胞以及大量的嗜酸性粒細胞和肥大細胞的浸潤，但缺乏CD8+T細胞的浸潤[22]。綿羊感染癢螨24 h內IL-4、IL-4R和IL-13的表達增加，亦揭示了癢螨病的早期階段會引起宿主發(fā)生Th2為主的免疫反應[6]。在本研究中，1分組的患兔Th1細胞因子IFN-γ和轉錄因子T-bet較健康兔增加（IFN-γ mRNA：1分組/0分組=1.505，蛋白：0分組=0.344 2pg/mg，1 分組=0.3664 pg/mg；T-bet mRNA：1分組/0分組=6.322），Th2細胞因子IL-4亦增加而轉錄因子GATA-3 mRNA則減少（IL-4 mRNA：1分組/0分組=1.808，蛋白：0分組=0.135 pg/mg，1分組=0.148 8 pg/mg；GATA-3 mRNA：1 分組/0 分組=0.553），表明此時的癢螨病患兔呈現(xiàn)混合型的Th1和Th2免疫反應。3分組的患兔IFN-γ較1分組增加（IFN-γ mRNA：3分組/0分組=2.365，蛋白：3分組=0.463 6 pg/mg），而IL-4 mRNA有所增高，但蛋白水平卻有所降低（IL-4 mRNA：3分組/0分組=1.849，蛋白：3 分組=0.131 6 pg/mg）；T-bet和 GATA-3 mRNA水平均較1分組降低，但T-bet的水平明顯高于GATA-3的水平，表明3分的癢螨病患兔Th1免疫反應較Th2免疫反應更有優(yōu)勢。5分組患兔的2種細胞因子（IL-4和IFN-γ）和2種轉錄因子（GATA-3和T-bet）均較3分組時有所降低，但IFN-γ和T-bet水平均高于健康兔（IFN-γ mRNA：5分組/0分組=1.493，蛋白：5 分組=0.348 2 pg/mg；T-bet mRNA：5分組/0分組=3.515），而IL-4和GATA-3均較健康兔低（IL-4 mRNA：5分組/0分組=0.808，蛋白：5分組=0.117 2 pg/mg；GATA-3 mRNA：5 分組/0 分組=0.453），表明此時宿主的免疫反應較3分時有所降低，但仍以Th1免疫反應為主。由此可見，新西蘭兔在感染癢螨后，在早期評分較低的1分呈現(xiàn)混合型Th1/Th2免疫反應，隨著癢螨數量的增加和結痂的增多評分達3分和5分時，Th2免疫反應受到抑制，而Th1免疫反應則有所增強。

新西蘭兔經人工感染癢螨后，癢螨利用前肢附著于兔耳部皮膚，造成皮膚損傷，同時分泌毒素引起皮膚發(fā)炎和瘙癢，家兔用腳撓耳部導致皮膚破裂，滲出液流出混同脫落的上皮細胞、被毛及污垢混雜在一起形成結痂，感染后約15 d外耳道內出現(xiàn)少量結痂達到評分1分，誘發(fā)宿主皮膚出現(xiàn)Th1細胞因子IFN-γ和轉錄因子T-bet以及Th2細胞因子IL-4的增高，呈現(xiàn)低水平的混合型Th1/Th2免疫反應，不足以清除已有的癢螨；隨著癢螨不斷地繁殖數量的增多，炎癥加重，此時誘發(fā)宿主的免疫反應以Th1為主，同時宿主的促炎性細胞因子IFN-γ增多（蛋白：1分組=0.366 4 pg/mg，3 分組=0.463 6 pg/mg），而抗炎因子IL-4降低（蛋白：1分組=0.148 8 pg/mg，3分組=0.131 6 pg/mg），從而進一步導致炎癥加重，炎性滲出物增多，使得宿主皮膚組織損傷愈加嚴重，皮損處產生更多的結痂，感染后約45 d兔的耳道和1/4耳郭出現(xiàn)結痂，評分達3分；隨著螨蟲數量的繼續(xù)增加，誘發(fā)的以Th1為主的免疫反應，無法抵御螨蟲的寄生，從而導致皮膚損傷愈加嚴重，耳道和3/4的耳郭出現(xiàn)結痂，達到評分5分。

由此可見，癢螨病的早期，誘發(fā)宿主呈現(xiàn)Th1和Th2的混合免疫反應，隨著病程的發(fā)展Th2免疫反應逐步受到抑制，而Th1免疫反應則逐漸增強，從而促進了炎癥反應的發(fā)生，使得宿主皮膚的損傷逐漸增強而達到高評分的病變。

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