副溶血弧菌與Hela細(xì)胞表面蛋白結(jié)合相關(guān)外膜蛋白的篩選和鑒定

王婧婷 ，陳 萌 ，李卓昱 ，袁增智 ，孫金生

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

副溶血弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，除了能夠感染海水甲殼類(lèi)、貝類(lèi)以及魚(yú)類(lèi)等水生動(dòng)物以外，其引發(fā)的人類(lèi)胃腸炎已成為世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2].

革蘭氏陰性菌的外膜由蛋白、糖和脂質(zhì)構(gòu)成，在細(xì)菌與宿主的相互關(guān)系中發(fā)揮著重要作用.外膜蛋白約占外膜全部成分的1/2，其數(shù)量和種類(lèi)隨著菌種和培養(yǎng)條件的不同而有所差異[3].外膜蛋白作為外膜的主要組分，在細(xì)菌的生命活動(dòng)中具有重要的生理功能.如富含β折疊結(jié)構(gòu)的外膜蛋白A（OmpA），不但維持著外膜的完整性，而且還是不同噬菌體的受體[4].微孔蛋白（OmpC）以非共價(jià)鍵與肽聚糖緊密結(jié)合，形成了相對(duì)非特異性的通道，在對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、代謝物質(zhì)運(yùn)輸、物質(zhì)合成方面起著重要作用.脂蛋白（Lpp）是含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，具有穩(wěn)定細(xì)菌外膜-肽聚糖復(fù)合體的功能[5].另外，某些病原菌外膜蛋白還具有黏附素的作用，有助于病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附[6-7].

由于病原菌的黏附作用與其致病性密切相關(guān)，因此探究VP外膜蛋白在菌體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行侵染過(guò)程中的作用有助于闡明VP的致病機(jī)制[8].本研究通過(guò)VP外膜蛋白與Hela細(xì)胞表面蛋白的互作實(shí)驗(yàn)，篩選出可與宿主細(xì)胞表面蛋白互作的一類(lèi)VP外膜蛋白，研究其與宿主細(xì)胞的黏附作用，為進(jìn)一步探究VP與宿主細(xì)胞的黏附作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

副溶血弧菌NY-172菌株，天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株、Hela細(xì)胞株、pET-28a、pET-32M質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器

C1000 Touch PCR儀、GDS-8000凝膠成像儀、蛋白質(zhì)電泳槽、核酸蛋白檢測(cè)儀，美國(guó)Bio-Rad公司.

1.2.2 試劑

Sal I和Xho I限制性?xún)?nèi)切酶，美國(guó)Takara公司；鎳柱，生工生物工程（上海）股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰酶，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；同源同組試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；多聚組氨酸標(biāo)簽單抗、HRP-標(biāo)記羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠二抗，天津三箭生物技術(shù)有限公司.

1.3 方法

1.3.1 Hela細(xì)胞表面蛋白的生物素化（biotin）標(biāo)記

將在細(xì)胞瓶中長(zhǎng)至單層的Hela細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗3次，加入預(yù)冷的PBS緩沖液，將細(xì)胞從瓶上輕輕刮下，置入15mL離心管中，離心收集細(xì)胞.用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，洗后用PBS緩沖液細(xì)胞重懸至2.5×107mL-1.加入濃度為2 mmol/L的NHS-PEG4-biotin試劑，4℃孵育30 min.用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，加入終濃度為100 mmol/L的甘氨酸終止液，于4℃顛倒混合15 min，終止后用PBS緩沖液離心清洗3次.取出1份細(xì)胞按體積比1∶250的比例加入FITC-Avidin試劑，于37℃孵育30 min，反應(yīng)結(jié)束后用PBS緩沖液洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光并拍照保存.剩余細(xì)胞加入適量裂解液重懸，4℃下裂解30 min，之后4℃下以12 000 r/min的速率離心30 min，取上清液保存于-80℃.

1.3.2 與細(xì)胞表面蛋白結(jié)合相關(guān)的外膜蛋白的篩選

取2個(gè)自旋柱，用PBS緩沖液離心清洗，分別加入中性卵白素樹(shù)脂，4℃下500 r/min離心1 min.PBS緩沖液離心清洗樹(shù)脂3次，將含生物素化表面蛋白的Hela細(xì)胞蛋白樣品加入其中一個(gè)自旋柱，另一個(gè)自旋柱作為陰性對(duì)照加入PBS緩沖液，于室溫下顛倒混合15 min，多次上樣，每次上樣結(jié)束后于4℃下500 r/min離心1 min.之后用PBS緩沖液離心清洗樹(shù)脂1次，分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.02%的生物素封閉液封閉未結(jié)合蛋白的樹(shù)脂，于室溫下孵育15 min.孵育后離心除去封閉液，用PBS緩沖液離心清洗樹(shù)脂3次，在自旋柱中加入使用PMSF法提取的副溶血弧菌的外膜蛋白[9]，可多次重復(fù)上樣，每次上樣時(shí)于4℃下顛倒混合1 h.上樣結(jié)束后離心除去樣品，并用洗滌液離心清洗樹(shù)脂5次，最后用剛好沒(méi)過(guò)樹(shù)脂的洗脫液于室溫下孵育5 min，孵育后于4℃下500 r/min離心1 min，收集洗脫物.將洗脫物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析并送至上海中科新生命公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定.

1.3.3 基因克隆、重組表達(dá)與純化

分析質(zhì)譜鑒定結(jié)果，從NCBI獲取VP的Peptidase、PLP（PirA Like Protein）、OmpW、OmpN、Chaperonin 等基因序列，經(jīng)THMHH以及SignalP 4.1在線(xiàn)預(yù)測(cè)跨膜區(qū)及信號(hào)肽.去除基因序列上的跨膜區(qū)、信號(hào)肽及終止密碼子后，設(shè)計(jì)引物，并在上、下游引物前分別添加一段15 bp左右的載體序列作為同源重組序列，設(shè)計(jì)的上、下游引物如表1所示.選取已報(bào)道的VP黏附因子——VpadF作為后續(xù)黏附因子鑒定時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of PCR primers

提取VP NY-172菌株基因組作為模板，使用表1中的引物分別擴(kuò)增出以上蛋白的編碼序列，純化后使用同源重組連接試劑盒將其與線(xiàn)性化的載體PET-28a或PET-32M進(jìn)行同源重組，得到PET-28a-Peptidase、PET-32M-OmpW、PET-32M-OmpN、PET-32M-PLP、PET-32M-Chaperonin重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)菌落PCR驗(yàn)證正確后，送樣測(cè)序.

挑選測(cè)序結(jié)果正確的克隆，將這些原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，參照杜欣軍等[10]的方法對(duì)各個(gè)表達(dá)菌的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳確定各個(gè)重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件，之后進(jìn)行大量表達(dá)并使用鎳柱進(jìn)行親和純化.對(duì)上清液中表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，之后通過(guò)透析將其緩沖液置換為PBS緩沖液；對(duì)包涵體中表達(dá)的重組蛋白則采取尿素梯度復(fù)性法進(jìn)行復(fù)性，于PBS緩沖液中進(jìn)行透析.

1.3.4 Western Blot驗(yàn)證重組蛋白

取5 μg純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白由PAGE膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用去離子水洗去SDS，使用TBST緩沖液振蕩洗滌PVDF膜3次，每次5 min.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉TBST緩沖液作為封閉液，于4℃下封閉過(guò)夜.封閉后，用TBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次5 min，清洗后將PVDF膜與多聚組氨酸標(biāo)簽單抗（稀釋比例為1∶1 000）于室溫下孵育2 h.孵育后用TBST緩沖液振蕩洗滌PVDF膜3次，每次5min，洗后將PVDF膜與HRP-標(biāo)記羊抗鼠IgG（稀釋比例為1∶5 000）于室溫下孵育2 h.孵育后使用TBST緩沖液振蕩洗滌PVDF膜5次，每次10 min.在避光條件下加入新配置的HRP-底物顯色試劑，反應(yīng)10 min，顯色完成后，使用去離子水沖洗PVDF膜以終止反應(yīng)，掃描拍照.

1.3.5 間接免疫熒光分析

在12孔板中加入細(xì)胞爬片進(jìn)行Hela細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為80%時(shí)用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，再向各孔分別加入100 μg重組蛋白或牛血清白蛋白（BSA），37℃下孵育1 h，加入PBS緩沖液的孔作為空白對(duì)照.孵育完成后每孔加入1mL體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定15 min，固定后用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，向各孔中加入1 mL多聚組氨酸標(biāo)簽單抗（稀釋比例為1∶500），37℃下孵育30 min.PBS緩沖液清洗3次，將異硫氰酸熒光素（稀釋比例為1∶1000）標(biāo)記的羊抗鼠二抗加入細(xì)胞孔中，37℃下避光孵育30 min.在避光條件下，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞5次，使用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞表面的熒光，拍照保存.

2 結(jié)果與分析

2.1 Hela細(xì)胞表面蛋白的生物素化標(biāo)記

由于A(yíng)vidin可特異性結(jié)合biotin，為證明Hela細(xì)胞的表面蛋白已被成功地生物素化，將FITC-Avidin試劑與生物素化后的細(xì)胞進(jìn)行孵育，并用FITC-Avidin試劑同樣處理未生物素化的Hela細(xì)胞作為對(duì)照組，觀(guān)察細(xì)胞表面熒光，結(jié)果如圖1所示.通過(guò)與對(duì)照組對(duì)比，證實(shí)Hela細(xì)胞的表面蛋白已經(jīng)被成功地生物素化，可以進(jìn)行Hela細(xì)胞蛋白的提取.

圖1 FITC-Avidin標(biāo)記生物素化的Hela細(xì)胞Fig.1 Detection of biotinylated Hela cells by FITC-Avidin

2.2 VP與Hela細(xì)胞表面蛋白結(jié)合外膜蛋白的篩選

提取VP的外膜蛋白后，將生物素化修飾的Hela細(xì)胞的表面蛋白結(jié)合于中性卵白素樹(shù)脂上，作為誘餌蛋白垂釣VP外膜蛋白，洗脫物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的蛋白分子質(zhì)量主要在50～100 ku之間，如圖2所示.

圖2 SDS-PAGE分析洗脫蛋白Fig.2 Representative SDS-PAGE analysis of the eluted protein

對(duì)洗脫物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共得到5個(gè)與Hela細(xì)胞表面蛋白黏附相關(guān)的VP外膜蛋白，質(zhì)譜峰如圖3所示.

對(duì)5種蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果如表2所示，這5種蛋白均為胞外蛋白，且OmpW和OmpN均在其他革蘭氏陰性菌中起到黏附宿主相關(guān)的作用.

2.3 重組蛋白的基因克隆、純化及Western Blot檢測(cè)

利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)純化后的重組蛋白，結(jié)果如圖4（a）所示，重組蛋白的條帶較單一，雜蛋白含量較少，說(shuō)明各個(gè)重組蛋白純化成功.對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，結(jié)果如圖4（b）所示，每種蛋白均與多聚組氨酸標(biāo)簽抗體有較強(qiáng)的結(jié)合，但重組蛋白Chaperonin結(jié)合條帶的相對(duì)分子質(zhì)量約為非重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的1/2，猜測(cè)Chaperonin蛋白可能發(fā)生了降解或解聚.

2.4 間接免疫熒光分析結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證各候選蛋白的作用，利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白黏附Hela細(xì)胞的能力，結(jié)果如圖5所示.

圖4 各重組蛋白的純化與檢測(cè)Fig.4 Representative SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins and Western Blot assay

由圖5可以看出，與陽(yáng)性對(duì)照組VpadF結(jié)果相比，OmpW、OmpN、Peptidase、PLP、Chaperonin 組在Hela細(xì)胞表面的熒光更明顯，說(shuō)明這5種重組蛋白均能與宿主細(xì)胞相結(jié)合.比較5種蛋白的細(xì)胞結(jié)合能力發(fā)現(xiàn)，OmpW、Chaperonin、Peptidase組的熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)，表明這3種蛋白與Hela細(xì)胞的黏附作用很強(qiáng)，更可能為副溶血弧菌的潛在黏附因子；OmpN的熒光強(qiáng)度次之；PLP組的熒光強(qiáng)度最弱，即PLP與Hela細(xì)胞的黏附作用也最弱.

圖5 間接免疫熒光驗(yàn)證各重組蛋白與Hela細(xì)胞間的相互作用Fig.5 Confirmation of the interaction between recombinant proteins and Hela cells by indirect immune-fluorescence assays

3 討論與結(jié)論

黏附作用對(duì)病原菌入侵宿主細(xì)胞具有重要意義[11]，外膜蛋白是革蘭氏陰性菌黏附因子的重要來(lái)源.本研究首次將生物素化的Hela細(xì)胞表面蛋白作為互作垂釣誘餌，通過(guò)親和層析的方法大規(guī)模垂釣并篩選鑒定副溶血弧菌可與宿主發(fā)生黏附的外膜蛋白，為規(guī)模化篩選鑒定副溶血弧菌的黏附因子奠定基礎(chǔ).最終篩選出了5種可黏附Hela細(xì)胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白，并對(duì)這些可能的黏附因子進(jìn)行功能驗(yàn)證.通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)OmpW、OmpN、Peptidase、PLP、Chaperonin重組蛋白均可結(jié)合于Hela細(xì)胞的表面，說(shuō)明這些蛋白均可能是VP黏附宿主細(xì)胞過(guò)程中重要的黏附素.Peptidase是相對(duì)分子質(zhì)量約為45×103的肽酶，在蠟樣芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞壁中的Peptidase FM是一種黏附素，并對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性[12].OmpW是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌外膜通道蛋白，在多種致病菌侵染宿主的過(guò)程中發(fā)揮重要作用.如霍亂弧菌的OmpW是一種黏附相關(guān)因子，與霍亂弧菌的侵襲力和毒力有關(guān)[13].在VP中，OmpW既是外膜通道蛋白，也是免疫原性蛋白.OmpN是一種外膜微孔蛋白，鮰愛(ài)德華氏菌的OmpN可與其免疫血清發(fā)生免疫反應(yīng)，說(shuō)明OmpN在鮰愛(ài)德華氏菌侵染宿主的過(guò)程中起到了重要作用[14].Chaperonin蛋白與大腸桿菌的GroEL蛋白具有較高同源性，位于菌體表面的GroEL蛋白有利于大腸桿菌黏附宿主的巨噬細(xì)胞，而表面具有GroEL的大腸桿菌也會(huì)導(dǎo)致小鼠更容易受到侵染并引起嚴(yán)重的腹膜炎[15].PLP是一種類(lèi)似于PirA毒素的蛋白，熒光發(fā)光桿菌中的PirA毒素對(duì)多種昆蟲(chóng)均具有口服殺蟲(chóng)的活性，是該細(xì)菌一種重要的毒素蛋白[16]，因此PLP可能作為毒素蛋白通過(guò)黏附宿主的表面再發(fā)揮其毒素作用，其是否具有黏附因子的作用有待進(jìn)一步研究.

綜上所述，本研究從VP中篩選并鑒定出了外膜蛋白 OmpW、OmpN、Peptidase、PLP、Chaperonin，是 VP菌潛在的黏附因子.該結(jié)果有助于進(jìn)一步探索副溶血弧菌的致病機(jī)制，為后續(xù)預(yù)防與治療副溶血弧菌的感染奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)：

[1]HARA-KUDO Y，KUMAGAI S.Impact of seafood regulations for Vibrio parahaemolyticus infection and verification by analyses of seafood contamination and infection[J].Epidemiology and Infection，2014，142（11）：2237-2247.

[2]CECCARELLI D，HASANNA，HUQ A，et al.Distribution and dynamics of epidemic and pandemic Vibrio parahaemolyticus virulence factors[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2013，3：97-106

[3] 陸盼盼，郭松林，關(guān)瑞章，等.致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014，30（4）：30-35.LU P P，GUO S L，GUAN R Z，et al.Review on the immunogenicity of pathogenic Vibrio outer membrane protein[J].Biotechnology Bulletin，2014，30（4）：30-35（in Chinese）.

[4]KHALID S，BOND P J，CARPENTER T，et al.OmpA：Gating and dynamics via molecular dynamics simulations[J].Biochimica et Biophysica Acta，2007，1778（9）：1871-1880.

[5] NGUYEN M T，G?TZ F.Lipoproteins of gram-positive bacteria：Key players in the immune response and virulence[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2016，80（3）：891-903.

[6] LITWIN C M，BYRNE B L.Cloning and characterization of an outer membrane protein of Vibrio vulnificus required for heme utilization：Regulation of expression and determination of the gene sequence[J].Infection&Immunity，1998，66（7）：3134-3141.

[7] AECKERSBERG F，LUPP C，F(xiàn)ELICIANO B，et al.Vibrio fischeri outer membrane protein OmpU plays a role in normal symbiotic colonization[J].Journal of Bacteriology，2001，183（22）：6590-6597.

[8]GHENEM L，ELHADI N，ALZAHRANI FAISAL，et al.Vibrio parahaemolyticus：A review on distribution，pathogenesis，virulence determinants and epidemiology[J].Saudi Journal of Medicine and Medical Sciences，2017，5（2）：93-103.

[9] 閻斌倫，張曉君，秦國(guó)民，等.4種病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析[J].海洋科學(xué)，2012，36（5）：71-74.YAN B L，ZHANG X J，QIN G M，et al.Isolation and antigenicity analysis of outer membrane proteins from 4 Pathogenic vibrio sp.[J].Marine Sciences，2012，36（5）：71-74（in Chinese）.

[10]杜欣軍，王學(xué)連，李萍，等.金黃色葡萄球菌表面蛋白SdrD的原核表達(dá)及抗體制備[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（3）：1-5.DU X J，WANG X L，LI P，et al.Prokaryotic expression and antibody preparation of SdrD surface protein of staphylococus aureus[J].Progress in Veterinary Medicine，2015，36（3）：1-5（in Chinese）.

[11]楊振泉，焦新安.副溶血弧菌毒力因子及其致病機(jī)理研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24（11）：1070-1073.YANG Z Q，JIAO X A.Advances of study on infection mechanism and virulence factor of Vibrio parahaemolyticus[J].Chinese Journal of Zoonoses，2008，24（11）：1070-1073（in Chinese）.

[12]TRAN S L，GUILLEMET E，GOHAR M，et al.Cwpfm （entfm）is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion，biofilm formation，and virulence[J].Journal of Bacteriology，2010，192（10）：2638-2642.

[13]李建華.霍亂弧菌外膜蛋白W的原核表達(dá)及抗原性分析[J].軍事醫(yī)學(xué)，2011，35（10）：30-32.LI J H.Expression of Vibrio cholerae outer membrane protein W and identification of its antigenicity[J].Military Medicine Science，2011，35（10）：30-32（in Chinese）.

[14]潘延樂(lè).鮰愛(ài)德華氏菌ompN基因的克隆及其原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的保護(hù)效果評(píng)價(jià)[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.PAN Y L.Study on Cloning and Protective Efficacy of Recombinant Outer Membrane Protein N m（rOmpN）-based Vaccine of Edwarsiella ictaluri[D].Yaan：Sichuan Agricultural University，2015（in Chinese）.

[15]ZHU H Y，LEE C Y，ZHANG D M，et al.Surface-associated GroEL facilitates the adhesion of Escherichia coli to macrophages through lectinlikeoxidizedlow-densitylipoproteinreceptor-1[J].Microbes&Infection，2013，15（3）：172-180.

[16]孫建宇.熒光發(fā)光桿菌TT01菌株pirAB基因的克隆表達(dá)及殺蟲(chóng)譜研究[D].廣州：中山大學(xué)，2012.SUN J Y.Cloning，Expression and Insecticidal Spectrum Analysis of the pirAB Gene from Photorhabdus luminescens TT01[D].Guangzhou：Sun Yat-Sen University，2012（in Chinese）.