去甲腎上腺素減輕脂多糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷*

胡 靜， 龍燕瓊， 岳 陽(yáng)， 劉作良

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410013)

膿毒癥(sepsis)是指由感染或有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。已有研究表明，在膿毒癥的病理生理改變中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)會(huì)受到損傷，是膿毒癥炎癥反應(yīng)的靶細(xì)胞；損傷的VECs釋放多種炎性因子，加重膿毒癥的進(jìn)展，故VECs又是效應(yīng)細(xì)胞[1-2]。兒茶酚胺類(lèi)藥物去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)是改善膿毒癥患者血流動(dòng)力學(xué)紊亂的常用藥物。本研究擬構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞膿毒癥損傷模型，初步探討NE對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其具體機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 藥品和試劑

NE和二甲基亞砜(Sigma)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；小牛血清(杭州四季青)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(TaKaRa)；TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10 ELISA試劑盒(武漢博士德)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天)；山羊抗血管內(nèi)皮型鈣黏素(VE-cadherin)抗體(Millipore)；HRP標(biāo)記的兔抗山羊 II 抗(MBI)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 解凍復(fù)蘇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12后加入含10%胎牛血清的DMEM養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中，再靜置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃)。每隔2 d換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞亞融合時(shí)0.25%胰蛋白酶消化傳代。取4～6代呈亞融合的細(xì)胞鋪種于6孔板或者12孔板，待細(xì)胞80%融合時(shí)進(jìn)行不同的處理。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基將剛消化離心的內(nèi)皮細(xì)胞重懸，以1×108/L的密度接種于96孔板，每孔200 μL，96孔板四周加200 μL PBS封孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，貼壁后棄細(xì)胞上清，加入新鮮的含1%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，同步化細(xì)胞。12 h后，實(shí)驗(yàn)分為4組，空白對(duì)照(control)組加入100 μL不含LPS的培養(yǎng)液，其余3組為實(shí)驗(yàn)組，分別加入LPS終濃度為50 mg/L和100 mg/L、200 mg/L 的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)12 h、24 h和48 h時(shí)分別取出96孔板，避光，每孔加入10 μL的MTT工作液(5 g/L)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 200 μL，置搖床上振蕩15 min至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔吸光度(A)。細(xì)胞抑制率(%)=(空白組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/空白組A值×100%。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10含量的測(cè)定 消收集細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10的含量。

2.4細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的測(cè)定 將細(xì)胞以1×108/L的密度接種于96孔板中, 藥物處理后, PBS沖洗細(xì)胞3遍, 加入含有10 μmol/L DCFH-DA 的培養(yǎng)液，37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min, 用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞3次, 然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，其激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

2.5Real-time PCR 應(yīng)用Prime Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參照基因引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。VE-cadherin的正向引物序列為5’-ACAGACCGCCGTCTAACTCAAA-3’，逆向引物序列為5’-AGATAGGCACCAGGACCTCACC-3’；GAPDH(內(nèi)參照)的正向引物序列為5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，逆向引物序列為5’-AGGTCCACCACTGACACGTT-3’。PCR 反應(yīng)參數(shù)為:預(yù)變性95 ℃ 10 s； 95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)，在延伸的過(guò)程中搜集熒光信號(hào)。于每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無(wú) cDNA的陰性對(duì)照，將 PCR產(chǎn)物做熔解曲線，以證實(shí)以上 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好。用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，計(jì)算2-ΔΔCt值以比較各組mRNA的表達(dá)。

2.6Western blot檢測(cè)蛋白水平 將指數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照(control)組、100 mg/L LPS組(LPS組)及LPS損傷與NE低、中、高劑量共同作用(LPS+50 mg/L NE、LPS+100 mg/L NE和LPS+200 mg/L NE)組，各處理組與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株共同孵育24 h后收集細(xì)胞，用PBS重懸，提取蛋白。蛋白樣品定量后與上樣緩沖液混合均勻，95 ℃ 5 min變性，自然冷卻后上樣于凝膠加樣孔內(nèi)，上樣量為20 μg，60 V集成、120 V恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜48 min后，用5%牛奶封閉1 h后加適量稀釋的 I 抗，4℃孵育16 h，洗膜后加適量稀釋的相應(yīng) II 抗，室溫?fù)u床反應(yīng) 1 h，洗膜后按照 ECL 發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色。

3 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組均數(shù)比較選擇單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls (SNK)檢驗(yàn)。使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞抑制率隨著LPS濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，當(dāng)LPS濃度達(dá)到100 mg/L，作用細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞抑制率達(dá)50%左右，選定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effects of different concentrations of LPS for diffe-rent time on the viability of the endothelial cells. Mean±SD.n=6*P<0.05vs12 h；#P<0.05vs24 h；△P<0.05vs50 mg/L；▲P<0.05vs100 mg/L.

圖1各組細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2 不同濃度NE對(duì)LPS損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性因子的影響

檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10的濃度，結(jié)果示，與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β和IL-2水平明顯上升, IL-10的濃度明顯下降(P<0.05)；與LPS組相比，不同濃度的NE可逆轉(zhuǎn)TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10的含量變化，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度NE對(duì)LPS損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性因子的影響

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

3 不同濃度NE對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的ROS水平上調(diào)的影響

內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)100 mg/L LPS處理24 h后，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞的ROS水平上升(P<0.05)；當(dāng)使用低、中、高濃度的NE預(yù)處理細(xì)胞后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖2。這表明NE對(duì)LPS引起的細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多有明顯的抑制作用。

Figure 2. The effects of NE on ROS production induced by LPS. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖2不同濃度NE對(duì)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平的影響

4 不同濃度NE對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的VE-cadherin mRNA下調(diào)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，100 mg/L LPS使內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，不同濃度(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)NE可恢復(fù)VE-cadherin mRNA的表達(dá)水平，見(jiàn)圖3。

5 不同濃度NE對(duì)LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，100mg/L LPS處理細(xì)胞后，細(xì)胞中VE-cadherin的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，不同濃度NE預(yù)處理細(xì)胞后，VE-cadherin的蛋白表達(dá)明顯上升，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The effects of NE on the mRNA expression of VE-cadherin induced by LPS. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group.

圖3不同濃度NE對(duì)LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherinmRNA表達(dá)的影響

討 論

血管內(nèi)皮在維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮極其重要的作用，在生理情況下，只有極小部分(<0.1%)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，膿毒癥病人血液中的凋亡內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并且與病人的預(yù)后呈線性關(guān)系[3]。膿毒癥中大量炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β和IL-2釋放入血可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[4];內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、脫落導(dǎo)致血管屏障功能受損并進(jìn)一步釋放促炎因子；血管通透性升高和防御功能減弱導(dǎo)致組織水腫，病原菌侵入組織，加重膿毒癥的發(fā)展，進(jìn)而引起有效循環(huán)血量不足和器官組織功能損害。

Figure 4. The effects of NE on VE-cadherin protein expression in the endothelial cells injured by LPS. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖4不同濃度NE對(duì)LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin蛋白表達(dá)的影響

VE-cadherin是內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性蛋白,位于內(nèi)皮細(xì)胞間連接處,是內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接的主要組成部分,屬于II型鈣黏蛋白[5]。膿毒癥時(shí)大量的炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)通過(guò)已知的、未知的信號(hào)途徑導(dǎo)致黏附連接的局部分解、黏附連接復(fù)合體的解體、胞漿內(nèi)肌動(dòng)蛋白微絲系統(tǒng)重組，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接受損，內(nèi)皮細(xì)胞間通透性增加。可能的機(jī)制主要包括膿毒癥時(shí)活化的中性粒細(xì)胞以及其它細(xì)胞可以釋放多種酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶，直接使血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VE-cadherin分解，細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)被破壞，引起通透性增加。Herwig等[6]研究顯示，在膿毒癥所致的急性呼吸窘迫綜合征中，VE-cadherin的表達(dá)減少是導(dǎo)致血管通透性增加的一項(xiàng)重要機(jī)制。

本文研究結(jié)果提示，LPS所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷使細(xì)胞處于明顯的氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)，VE-cadherin的 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯抑制，TNF-α、IL-1β和IL-2水平明顯上升, IL-10的濃度明顯下降；不同濃度的NE處理能抑制LPS所致VE-cadherin的下調(diào)，并抑制炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-2的水平，改善內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為L(zhǎng)PS通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎因子而抑制VE-cadherin的水平，其機(jī)制可能是LPS誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境中TNF-α、IL-1β和IL-2的表達(dá)，從而激活包括NF-κB在內(nèi)的一系列下游信號(hào)通路，進(jìn)一步導(dǎo)致促炎因子的上調(diào)，另一方面LPS損傷內(nèi)皮細(xì)胞后還可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和活性氧簇的生成，從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能造成損傷。NE能夠明顯逆轉(zhuǎn)感染性患者外周血管擴(kuò)張，改善胃腸道血液灌注，對(duì)腸道黏膜屏障具有保護(hù)作用[7]，我們的研究結(jié)果表明NE的內(nèi)皮保護(hù)作用可能是通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮損傷中VE-cadherin的表達(dá)及對(duì)氧化應(yīng)激水平的抑制而發(fā)揮。本實(shí)驗(yàn)雖然對(duì)NE的內(nèi)皮保護(hù)作用及其機(jī)制做了初步探討，但仍需要大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NE發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。

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