黃芪甲苷通過(guò)調(diào)控PKD1-HDAC5-VEGF通路促進(jìn)心肌梗死大鼠血管新生*

付衛(wèi)云， 劉 暖， 王延柯， 趙 威， 李 星， 楊 雷， 毛秉豫

(南陽(yáng)理工學(xué)院， 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 南陽(yáng) 473004)

心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈閉塞造成其供應(yīng)區(qū)域內(nèi)心肌的嚴(yán)重缺血缺氧而引發(fā)的心肌組織壞死，嚴(yán)重危害患者的健康。血管新生指通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量生長(zhǎng)、遷移、分化和管腔形成，在現(xiàn)存血管的基礎(chǔ)之上形成新生血管的過(guò)程[1]。蛋白激酶D1(protein kinase D1, PKD1)又稱PKCμ，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，但其結(jié)構(gòu)、酶學(xué)和其它調(diào)控性能等方面和蛋白激酶C家族成員又有著顯著的差異。本項(xiàng)目組前期研究結(jié)果證實(shí)，PKD1在體內(nèi)外均有顯著的促血管新生作用，而且這一作用和PKD1上調(diào)VEGF及其受體KDR的表達(dá)密切相關(guān)[2]。PKD1直接的下游靶標(biāo)蛋白是組蛋白脫乙酰酶5(histone deacetylase 5，HDAC5)，其在抑制調(diào)控基因的表達(dá)和誘導(dǎo)染色質(zhì)的修飾中起到重要作用。PKD1必須和HDAC5結(jié)合后才能上調(diào)HDAC5控制的基因表達(dá)從而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖[3]。

本項(xiàng)目組的前期研究還證實(shí)，黃芪具有調(diào)控骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞和誘導(dǎo)心肌梗死大鼠心肌組織中新的血管生成而發(fā)揮強(qiáng)大的促血管新生作用[4-5]。黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)分子式為C41H68O14，為中藥黃芪甲苷的最主要成分之一。本研究在以上基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步研究探討AS-IV是否通過(guò)調(diào)控PKD1-HDAC5-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號(hào)通路而發(fā)揮促大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器、藥物與試劑

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，8 周齡，(200±20) g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2015-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為1001297。大鼠采用恒溫恒濕的標(biāo)準(zhǔn)方式飼養(yǎng)。

HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；PowerPac HC垂直型電泳儀(BIO-RAD)；CUT6062病理切片機(jī)和MTMI全密閉自動(dòng)脫水機(jī)(SLEE)；TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)(深圳博大精科技實(shí)業(yè)有限公司)；Bullet Blender Storm組織細(xì)胞破碎儀(Next Advance)；Tis型熒光顯微鏡及NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)(Nikon)。

AS-IV(上海寶曼生物科技有限公司，批號(hào)84687434，HPLC≥98%)；兔抗PKD1多克隆抗體(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，批號(hào)70R37566)；兔抗HDAC5多克隆抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，批號(hào)137951)；抗VEGF單克隆抗體(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，批號(hào)A0408100)；羊抗兔IgG(洛陽(yáng)市佰泰科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)OV0303)；DAB顯色液(北京麥瑞博生物科技有限公司，批號(hào)DA10103)；PKD1特異阻斷劑CID755673(Med-ChemExpress，批號(hào)2011756)；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1模型的建立 SD大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定在預(yù)先備有手術(shù)鋪巾的手術(shù)臺(tái)上，連接入心電監(jiān)護(hù)儀，常規(guī)消毒。在頸部正中胸骨上緣1 cm處縱切，行氣管插管，待暴露氣管后，于胸骨左側(cè)2～3肋間隙正中線旁開5 mm縱向開口，取心尖搏動(dòng)最明顯處鈍性分離肌層，深入穿破胸膜，剪開心包膜，用無(wú)菌棉簽將心尖部向上輕輕推起，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐連線中點(diǎn)處，左心耳下3 mm處，用7-0型外科縫合線將左冠狀動(dòng)脈前降支連同少量心肌一起結(jié)扎，進(jìn)針深度約1 mm，結(jié)扎后肉眼可見結(jié)扎下方左心室心尖部顏色變暗，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高，QRS波增寬，以此為標(biāo)準(zhǔn)確定心肌梗死模型復(fù)制成功。撤去無(wú)菌紗布，待左肺充盈復(fù)位后，將胸肋挑起，然后進(jìn)行不連續(xù)縫合(閉胸前必須排出胸部空氣)，從切口處由里至外縫合并關(guān)閉胸部。假手術(shù)(sham)組大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支僅穿線而不結(jié)扎。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素80萬(wàn)單位以預(yù)防感染。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 造模后存活達(dá)48 h以上的大鼠被隨機(jī)分為模型(model)組、AS-IV治療組(40 mg·kg-1·d-1)和AS-IV(40 mg·kg-1·d-1)+CID755673(100 μg/L)組，每組8只。另設(shè)假手術(shù)組和DMSO組。AS-IV溶于1%DMSO中，CID755673溶于生理鹽水中。AS-IV+CID755673組在給予AS-IV后立刻注射CID755673；假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水；DMSO組給予含1%DMSO的等量生理鹽水。給藥方式均為尾靜脈注射，給藥4周后處死大鼠。

2.3HE染色 取大鼠心尖部心肌組織，置入10%的多聚甲醛浸泡固定12 h后，制作厚度為3～4 μm的組織切片，去離子水沖洗1～2 min后，蘇木精染色50 s，再次用去離子水沖洗1～2 min后，置入無(wú)水乙醇(含1% HCl)中固定30 s，伊紅染色6～8 s，去離子水沖洗1～2 min后，無(wú)水乙醇固定3 min，石蠟包埋，取5個(gè)不同視野觀察分析。

2.4Masson染色 心肌組織取材同2.3部分。將脫蠟和脫水處理后的切片再用1%的鹽酸溶液處理3～5 s后沖洗干凈，用溫和的堿性品紅溶液染色3 min后去離子水沖洗干凈，1%的磷鉬酸溶液處理1 min，去離子水去除殘留的磷鉬酸溶液后，2%苯胺藍(lán)溶液染色2 min，95%的乙醇沖洗脫水，干燥后包埋處理。染色后，心肌膠原纖維在光鏡下呈藍(lán)綠色，心肌組織呈現(xiàn)紅色。

2.5RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中PKD1、HDAC5和VEGF的mRNA表達(dá)水平 應(yīng)用IKA-T25勻漿機(jī)將從-80 ℃冰箱取出的大鼠心肌組織制成勻漿，4 ℃、12 000×g離心5 min，Trizol法提取總RNA。查找GenBank中PKD1、HDAC5和VEGF的序列，分別設(shè)計(jì)其上、下游引物，見表1。根據(jù)說(shuō)明書指導(dǎo)，每組心肌組織取1 μg，首先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，94 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min、45 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。配制1%瓊脂糖凝膠，取2 μg反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，AlphaView SA軟件分析PKD1、HDAC5、VEGF與β-actin的相對(duì)灰度比值。

表1 引物序列

F: forward； R: reverse

2.6免疫組織化學(xué)染色 心肌組織取材同2.3部分。將脫蠟的組織分別置于二甲苯和無(wú)水乙醇溶液中各浸泡3次，每次20 min，95%和85%乙醇中依次浸入1 s，去離子水沖洗3 min，置于PBS液中3 min，再將組織放入容器中，加入沸騰的修復(fù)液，蓋緊蓋子，25 min后取出，PBS液沖洗3次，每次3 min；H2O2祛除組織玻片上的過(guò)氧化酶，時(shí)間為6 min；PBS液再?zèng)_洗3次，每次3 min；加入抗PKD1、HDAC5和VEGF的 I 抗，置入冰箱冷藏12 h；12 h后取出組織，PBS液中重復(fù)3次，每次3 min，徹底清除表面雜質(zhì)和抗體；加入 II 抗，常溫孵育15 min；加入DAB顯示液孵育3 min，顯微鏡下觀察顯色情況；去離子水祛除組織玻片上多余的顯色液；再用蘇木精染色40 s，分別用95%乙醇和1%HCl浸洗1 s，清水洗5 min，沖洗完畢后放入PBS液3 min，用濃度分別85%和95%的乙醇分別蘸洗，置入二甲苯液，重復(fù)3次，封片。光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)不重復(fù)視野，用NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)計(jì)算出各個(gè)視野下PKD1、HDAC5和VEGF蛋白的平均吸光度。

2.7Western blot法檢測(cè)蛋白水平 組織勻漿制作方法同2.5，4 ℃、12 000×g離心5 min，用Bradford法檢測(cè)提取的總蛋白濃度，配制12%的SDS-PAGE，取20 μg提取的蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標(biāo)記1∶1 000稀釋的抗PKD1、HDAC5和VEGF的 I 抗，4 ℃過(guò)夜，洗膜，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶2 000稀釋)孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影。應(yīng)用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HE染色觀察

假手術(shù)和DMSO組大鼠心肌組織完整，分布均勻、排列有序，心肌細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)邊緣分明(綠色箭頭所示)，血管完整度好，血管腔內(nèi)有紅細(xì)胞；與對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞顏色較淺，心肌組織排列紊亂，部分心肌細(xì)胞破碎或者輪廓不清，存在核溶解現(xiàn)象，伴中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭所示)，梗死的心肌組織被膠原纖維取代；和模型組比較，AS-IV治療組心肌組織排列較為整齊，分布均勻，組織細(xì)胞整體顏色加深(綠色箭頭所示)，成纖維細(xì)胞所占比例明顯下降，血管管腔完整；AS-IV+CID755673組心肌細(xì)胞顏色變淺，部分心肌細(xì)胞排列錯(cuò)亂形態(tài)不一，有輪廓模糊、核質(zhì)不清現(xiàn)象出現(xiàn)(紅色箭頭所示)，見圖1。

Figure 1. Effect of AS-IV on the pathological changes of myocardial tissues in rats with myocardial infarction (HE staining，×200).

圖1AS-IV對(duì)心肌梗死大鼠心肌組織病理變化的影響

2 Masson染色觀察

假手術(shù)和DMSO組大鼠心肌組織外形規(guī)整、清晰，整個(gè)鏡下視野呈現(xiàn)紅色(綠色箭頭所示)，血管清晰，部分血管周圍伴有少量的藍(lán)色膠原組織；模型組大鼠紅色心肌組織明顯減少且排列紊亂，壞死的心肌組織被藍(lán)色的膠原纖維取代(紅色箭頭所示)，壞死的心肌周圍伴有排列錯(cuò)亂的肉芽組織，血管有破碎現(xiàn)象，部分管腔狹窄或者閉合；和模型組比較，AS-IV治療組心肌組織排列規(guī)則，紅色心肌組織占比較高(綠色箭頭所示)，藍(lán)色膠原纖維組織數(shù)量較模型組顯著減少，伴大量新生的肉芽組織(黃色箭頭所示)；而加入CID755673阻斷劑后，心肌組織排列再度趨向紊亂，部分組織斷裂，紅色心肌組織所占比例明顯減少，再次出現(xiàn)較多的藍(lán)色膠原組織(紅色箭頭所示)，血管形態(tài)不夠完整，層次不清，管腔變窄，伴有較多新生的肉芽組織(黃色箭頭所示)，見圖2。

Figure 2. Effect of AS-IV on the changes of collagen fibres in rats with myocardial infarction (Masson staining，×200).

圖2AS-IV對(duì)心肌梗死大鼠心肌組織膠原纖維變化的影響

3 AS-IV對(duì)大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF的mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)和DMSO組比較，模型組大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF的mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，AS-IV治療組大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；加入CID755673阻斷劑后，大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF的mRNA表達(dá)水平較AS-IV組顯著降低(P<0.01)，但仍明顯高于模型組和對(duì)照組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The effect of AS-IV on the mRNA protein expression of PKD1, HDAC5 and VEGF in the rats with myocardial infarction. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsmodel group；▲▲P<0.01vsAS-IV group.

圖3AS-IV對(duì)大鼠心肌細(xì)胞中PKD1、HDAC5和VEGFmRNA表達(dá)的影響

4 AS-IV對(duì)大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組和DMSO組相比，模型組大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；而與模型組相比，AS-IV治療組大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；加CID755673阻斷劑后，大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白的表達(dá)水平較AS-IV組顯著降低(P<0.01)，但明顯高于模型組和對(duì)照組(P<0.05)，見圖4。

免疫組化結(jié)果表明，心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)VEGF表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞呈黃色或棕黃色，而心肌細(xì)胞胞核內(nèi)PKD1和HDAC5表達(dá)陽(yáng)性的在細(xì)胞呈黃色或棕褐色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組和DMSO組大鼠心肌組織胞漿中VEGF表達(dá)陽(yáng)性和胞核中PKD1和HDAC5表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于模型組；AS-IV治療組大鼠心肌組織胞漿VEGF和胞核PKD1和HDAC5蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞顯著高于模型組(P<0.01)；和AS-IV治療組相比，AS-IV+CID755673組大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少(P<0.01)，但仍明顯高于模型組和對(duì)照組(P<0.05)，見圖5。

Figure 4. The effect of AS-IV on the protein expression of PKD1, HDAC5 and VEGF in the rats with myocardial infarction. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsmodel group；▲▲P<0.01vsAS-IV group.

圖4AS-IV對(duì)大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白表達(dá)的影響

討 論

心肌細(xì)胞屬于終末細(xì)胞，一旦出現(xiàn)心肌梗死就會(huì)造成不可逆的組織缺血壞死，繼而誘發(fā)機(jī)體的一種自我保護(hù)反應(yīng)，生成大量的肉芽組織并轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原纖維使心臟的正常生理功能嚴(yán)重受損[6]。本研究經(jīng)HE染色和Masson染色結(jié)果均證實(shí)，心肌梗死模型組大鼠心肌組織破壞嚴(yán)重，有明顯的核溶解現(xiàn)象，伴血管大量破損或者丟失，增生的肉芽組織逐漸老化，取而代之以纖維結(jié)締組織，進(jìn)一步阻礙新生血管的形成。這和之前的研究結(jié)果高度一致[7-9]。

黃芪是一種醫(yī)治心肌梗死的經(jīng)典中藥材之一，其通過(guò)補(bǔ)氣化瘀改善壞死心肌的阻滯現(xiàn)象，刺激肉芽組織向毛細(xì)血管轉(zhuǎn)化繼而達(dá)到血液再通。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪在皮膚表面?zhèn)诮Y(jié)痂過(guò)程中能縮短愈合時(shí)間[10-11]，并且黃芪有促進(jìn)大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用，繼而促進(jìn)新生血管的發(fā)育和成熟[4]。我們之前的研究也證實(shí)，黃芪提取物具有促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移及生成血管的能力[5]。本研究中，AS-IV治療組，受損的心肌組織中有大量的肉芽組織生成，同時(shí)伴有結(jié)構(gòu)完整的新生毛細(xì)血管，紅色心肌組織所占比例也較模型組顯著升高。這和之前的研究結(jié)果相一致[4, 7-8]，這表明AS-IV有顯著的促受損心肌組織血管新生的作用。

Figure 5. The effect of AS-IV on the protein expression of PKD1, HDAC5 and VEGF in the rats with myocardial infarction (immunohistochemistry, ×400). Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsmodel group；▲▲P<0.01vsAS-IV group.

圖5AS-IV對(duì)大鼠心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF蛋白表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)、免疫組化和Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AS-IV有顯著上調(diào)PKD1、HDAC5和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)的作用。之前的文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)PKD1調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞參與的血管新生進(jìn)程[6,12]。PKD1的功能主要是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的肥大，激活血小板[12]。HDAC5具有誘導(dǎo)染色質(zhì)的修飾和抑制調(diào)控基因表達(dá)的作用，是內(nèi)皮細(xì)胞中PKD1直接的下游靶標(biāo)蛋白[6, 13]。PKD1和HDAC5結(jié)合后上調(diào)HDAC5控制的基因表達(dá)而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，尤其是參與調(diào)節(jié)VEGF誘導(dǎo)的血管新生。VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞中HDAC5區(qū)域中絲氨酸259/498殘基上依賴PKD1的磷酸化作用[14]。VEGF激活后誘導(dǎo)HDAC5從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的易位，進(jìn)而誘導(dǎo)MEF2的基因表達(dá)、遷移及管腔形成，而MEF2家族在血管形成和維持血管完整性的作用方面起著重要作用[15]。

CID755673是PKD1的特異阻斷劑。本研究中，加入CID755673處理后，紅色的心肌組織所占比例再度降低，并且與AS-IV治療組比較，PKD1、HDAC5和VEGF的表達(dá)均顯著下調(diào)。這表明CID755673可以阻斷AS-IV上調(diào)PKD1表達(dá)的作用。之前本課題組的研究證實(shí)，PKD1能明顯促進(jìn)大鼠EPCs的黏附、遷移和增殖，上調(diào)EPCs中VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[1, 6]。PKD1還可以促進(jìn)心肌組織中VEGF及其受體KDR的上調(diào)，誘導(dǎo)生成多種生長(zhǎng)因子聯(lián)合發(fā)揮作用，在修復(fù)缺血受損心肌中發(fā)揮著重要的作用[2]。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們可以推測(cè)，AS-IV可以通過(guò)調(diào)控PKD1-HDAC5-VEGF信號(hào)通路而發(fā)揮促大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用。

我們之前的研究證實(shí)，CID755673是可以較為徹底地阻斷單一的PKD1的促血管新生作用[2, 15]。但有意思的是，本研究中，CID755673處理后的心肌組織中PKD1、HDAC5和VEGF的表達(dá)盡管與AS-IV組相比顯著降低，但仍明顯高于模型組。這很可能是由于AS-IV具有多靶點(diǎn)效應(yīng)的結(jié)果，也是我們下一步深入探討的內(nèi)容。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yang L, Mao BY, Liu N． Angiogenesis function of salidroside in myocardium of rats with myocardial ischemia[J]．Int J Clin Exp Med, 2017, 10(3)：4957-4962.

[2] 楊 雷， 劉 暖， 毛秉豫， 等. 蛋白激酶D1促血管新生的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析[J]．中國(guó)病理生理雜志， 2016, 32(1)：146-150， 155.

[3] Ian ME, Ian CZ. Protein kinase D in vascular biology and angiogenesis[J]. Iubmb Life, 2011, 63(4)：258-263.

[4] 劉 暖， 楊 雷， 毛秉豫， 等． 黃芪提取物對(duì)大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015, 21(19)：92-96.

[5] 劉 暖， 毛秉豫， 楊 雷， 等． 黃芪提取物對(duì)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用[J]. 天津醫(yī)藥, 2015, 43(10)：1093-1096， 1217.

[6] Luo KQ, Long HB, Xu BC. Reduced apoptosis after acute myocardial infarction by simvastatin[J]. Cell Biochem Biophys, 2014, 71(2)：735-740.

[7] 楊 雷， 毛秉豫， 徐國(guó)昌， 等． 黃芪和丹參提取物配伍對(duì)大鼠心肌梗死后心肌組織病理變化的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(8)：175-179.

[8] 楊 雷， 毛秉豫， 徐國(guó)昌， 等. 黃芪提取物對(duì)大鼠心肌梗死后心肌組織PKD1蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(4)：512-519.

[9] 楊 雷， 毛秉豫. 芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死大鼠心肌的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012, 18(5)：206-210.

[10] Wang SG, Xu Y, Chen JD, et al. Astragaloside IV stimulates angiogenesis and increases nitric oxide accumulation via JAK2/STAT3 and ERK1/2 pathway[J]. Molecules, 2013, 18(10)：12809-12819.

[11] Chen X, Peng LH, Shen YH, et al. Astrangaloside IV-loaded nanoparticle-enriched htdrogel induces wound hea-ling and anti-scar activity through topical delivery[J]. Int J Pharm, 2013, 447(1-2)：171-181.

[12] Evans IM, Bagherzadeh A, Charles M, et al. Characterization of the biological effects of a novel protein kinase D inhibitor in endothelial cells[J]. Biochem J, 2010, 429(3)：565-572.

[13] Ha CH, Wang W, Jhun BS, et al. Protein kinase D-dependent phosphorylation and nuclear export of histone deacetylase 5 mediates vascular endothelial growth factor-induced gene expression and angiogenesis[J]. J Biol Chem, 2008, 283(21)：14590-14599.

[14] Wang S, Li X, Parra M, et al. Control of endothelial cell proliferation and migration by VEGF signaling to histone deacetylase 7[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(22)：7738-7743.

[15] 劉 暖， 楊 雷， 毛秉豫， 等. 蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞中的促血管新生作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2015, 31(9)：1259-1263.