內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對小鼠卵巢卵泡發(fā)育的影響

黃寧，于洋

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞內(nèi)的重要細胞器之一，與細胞內(nèi)分泌蛋白及膜蛋白的合成折疊、脂質(zhì)代謝、甾體激素合成密切相關(guān)，同時作為鈣離子貯存庫，發(fā)揮細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)維持的重要作用［1-3］。一些生理或病理情況，如低氧［4］、能量不足［5］、鈣離子濃度異常［6］以及游離脂肪酸含量過多［7］均會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細胞的損傷，細胞激活未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答（UPR）可維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，促進細胞存活。UPR通過激活三條經(jīng)典通路——PERK通路、IRE1α通路、ATF6通路，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊異常的信號傳遞至細胞核、細胞質(zhì)乃至整個細胞，通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)流入負擔，增強蛋白質(zhì)折疊能力，誘導錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解，從而促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)［8］。

目前，已有文獻報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與卵巢生理功能及疾病發(fā)病密切相關(guān)，但是其具體的分子途徑尚不清楚。卵泡的生長主要表現(xiàn)為卵母細胞體積的增長及顆粒細胞的增殖。顆粒細胞的快速增殖需要大量蛋白質(zhì)的支持，同時可能會造成局部的缺氧環(huán)境，從而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR［9-10］。本研究旨在探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在體內(nèi)環(huán)境中對卵巢生理功能的調(diào)節(jié)作用，利用經(jīng)典內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導物衣霉素經(jīng)腹腔注射建立小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，通過與對照組比較UPR標志分子的表達差異，明確小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 實驗動物為10只C57品系雌性小鼠。所有小鼠均購自北京維通利華實驗動物中心，均為SPF級。實驗中所使用動物的操作流程均經(jīng)我院倫理委員會審核批準。所有小鼠飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，相對濕度為（55±10）%，SPF環(huán)境，光照時間為12h光照/12h黑暗，自由攝食飲水。動物隨機分為對照組和實驗組，對照組4只，實驗組6只。對照組每只小鼠腹腔注射150 mmol/L葡萄糖溶液溶解的二甲基亞砜（DMSO），而實驗組每只小鼠注射150 mmol/L葡萄糖溶液溶解的衣霉素。分別于0、24、48h各注射1次藥物，第3次注射后4h處死小鼠，收集小鼠卵巢。

1.2 HE染色 將收集的小鼠卵巢立即放入4%的多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟，100%、95%、90%、80%及70%的乙醇由高到低至切片入水。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。切片放入自來水中洗去多余的蘇木精染料。70%乙醇配制的0.5%～1%鹽酸對切片分色數(shù)秒到數(shù)十秒。放入0.5%～1%氨水中30～60 s藍化。0.5%～1%伊紅染料染色2～3 min。100%、95%、90%、80%及70%的乙醇從低到高脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，樹膠封片。

1.3 RNA的提取及RT-qPCR實驗 采用Quick-RNA MiniPrep kit（ZYMO Research）試劑盒提取組織 RNA，使用NanoDrop分光光度計檢測提取的RNA的濃度和純度。取1 μg RNA使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR實驗采用7500 Real-Time PCR儀（Applied Biosystems）完成。以β-actin為內(nèi)參照，引物序列見表1。體系為：1 μL cDNA樣品，各 1 μL 上下游引物，7 μL 水，10 μL SYBR green mix（Applied Biosystems）。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min；40個循環(huán)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果。

Tab.1 The primer sequences used for real-time quantitative PCR表1 實時定量PCR中使用的引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立 與對照組相比，實驗組小鼠卵巢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子HSPA5、CHOP、ATF4mRNA表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Expression of ER stress related genes表2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達情況

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對小鼠卵巢卵泡發(fā)育的影響 對照組小鼠卵巢中可以看到各期發(fā)育的卵泡，在衣霉素處理后，小鼠卵巢中卵泡數(shù)量明顯減少，只有少數(shù)極小的卵泡，見圖1。

Fig.1 HE staining showing ovaries of mice（×40）圖1 HE染色檢測小鼠卵巢變化（×40）

3 討論

卵巢是一個長期處在動態(tài)變化中的器官。成年人的卵巢，無論是其結(jié)構(gòu)還是功能，都存在周期性變化的特征。卵巢既具有產(chǎn)生卵母細胞和維持卵母細胞分裂生長的生殖作用，也具有分泌性激素的內(nèi)分泌功能，而卵泡是執(zhí)行卵巢生殖和內(nèi)分泌功能的基本單位，卵泡的質(zhì)量和數(shù)量決定著生殖潛能和生殖周期。卵泡主要包括了最內(nèi)層的卵母細胞、包裹卵母細胞的顆粒細胞以及卵泡最外層的膜細胞，其發(fā)育經(jīng)歷了4個過程：即始基卵泡、次級卵泡、竇前卵泡及排卵前卵泡［11］。在卵泡發(fā)育的整個過程中，只有有限的卵泡（大約300～400個或者整體的1%）發(fā)育成熟并進行排卵，大多數(shù)卵泡在發(fā)育的各個階段逐漸退化，發(fā)生卵泡閉鎖。大量研究已經(jīng)明確了下丘腦-垂體-卵巢軸在卵泡閉鎖中的重要作用［12］，但對于卵巢局部微環(huán)境及卵泡內(nèi)生殖細胞體細胞對卵泡閉鎖的影響尚未完全闡明。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導激活的UPR是一個集適應(yīng)性應(yīng)答和凋亡性應(yīng)答于一體的雙重反應(yīng)途徑，輕度或短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活三條經(jīng)典通路改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，促進細胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)激活時，UPR會誘導激活下游凋亡通路，促使細胞凋亡以避免對整個器官的損害［13］。UPR對于改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，但過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成UPR凋亡途徑的啟動被認為參與了多種疾病的發(fā)生。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活會促進顆粒細胞凋亡，顆粒細胞可能參與卵泡閉鎖過程［14］。顆粒細胞是卵泡的主要細胞成分，不僅對維持卵母細胞的生長發(fā)育至關(guān)重要，也是性激素合成的主要場所。研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡閉鎖的早期階段，凋亡主要發(fā)生在顆粒細胞層，而非卵母細胞或膜細胞層，因此顆粒細胞被視為卵泡閉鎖的啟動者［15］。有實驗在羊卵巢各級卵泡顆粒細胞中檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羊卵巢的閉鎖卵泡和未閉鎖卵泡的顆粒細胞中均檢測到了UPR標志分子GRP78（HSPA5）的表達，而UPR中與凋亡密切相關(guān)的CHOP分子的表達僅在閉鎖卵泡的顆粒細胞中檢測到，未閉鎖卵泡中并沒有檢測到；另外，閉鎖卵泡中GRP78和CHOP的分布與閉鎖卵泡中凋亡的顆粒細胞分布一致，均位于閉鎖卵泡卵泡腔側(cè)顆粒細胞［14］。也有研究利用體外實驗探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對顆粒細胞的影響，通過加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導物衣霉素或加入無血清培養(yǎng)液模擬營養(yǎng)缺乏環(huán)境誘導顆粒細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導致了顆粒細胞凋亡［14］，這進一步驗證了UPR在調(diào)節(jié)顆粒細胞凋亡中的重要作用。在已建立的小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，本研究結(jié)果顯示與對照組相比，衣霉素處理后的小鼠卵巢各期卵泡數(shù)均明顯減少，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯抑制了小鼠卵巢卵泡的發(fā)育。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活凋亡反應(yīng)途徑促進顆粒細胞凋亡的作用有關(guān)，而顆粒細胞凋亡是導致卵泡閉鎖的重要因素。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是甾體激素合成的重要場所，雌、孕、雄激素的合成依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的精密配合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，不僅會破壞激素合成的局部環(huán)境，也可能干擾激素合成相關(guān)酶的表達，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激很可能影響了性激素合成水平，從而影響了卵泡發(fā)育。

［1］Wang Q，Groenendyk J，Michalak M.Glycoprotein quality control and endoplasmic reticulum stress［J］.Molecules，2015，20（8）：13689-13704.doi：10.3390/molecules200813689.

［2］Daniele T，Schiaffino MV.Lipid transfer and metabolism across the endolysosomal-mitochondrial boundary［J］.Biochim Biophys Acta，2016，1861（8 Pt B）：880-894.doi：10.1016/j.bbalip.2016.02.001.

［3］Duan XQ，Li YH，Zhang XY，et al.Mechanisms of intracellular calcium homeostasis in MC3T3-E1 cells and bone tissues of Sprague-Dawley rats exposed to fluoride［J］.Biol Trace Elem Res，2016，170（2）：331-339.doi：10.1007/s12011-015-0465-6.

［4］Gao Y，Jia P，Shu W，et al.The protective effect of lycopene on hypoxia/reoxygenation-induced endoplasmic reticulum stress in H9C2 cardiomyocytes［J］.Eur J Pharmacol，2016，774：71-79.doi：10.1016/j.ejphar.2016.02.005.

［5］Marjon PL，Bobrovnikova-Marjon EV，Abcouwer SF.Expression of the pro-angiogenic factors vascular endothelial growth factor and interleukin-8/CXCL8 by human breast carcinomas is responsive to nutrient deprivation and endoplasmic reticulum stress［J］.Mol Cancer，2004，3：4.doi：10.1186/1476-4598-3-4.

［6］Zhou Y，Sun P，Wang T，et al.Inhibition of calcium influx reduces dysfunction and apoptosis in lipotoxic pancreatic beta-cells via regulation of endoplasmic reticulum stress［J］.PLoS One，2015，10（7）：e0132411.doi：10.1371/journal.pone.0132411.

［7］Cui W，Ma J，Wang X，et al.Free fatty acid induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis of beta-cells by Ca2+/calpain-2 pathways［J］.PLoS One，2013，8（3）：e59921.doi：10.1371/journal.pone.0059921.

［8］Rond，Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（7）：519-529.doi：10.1038/nrm2199.

［9］Monniauxd，Michel P，Postel M，et al.Multi-scale modelling of ovarian follicular development：From follicular morphogenesis to selection for ovulation［J］.Biol Cell，2016，108（6）：149-160.doi：10.1111/boc.201500087.

［10］Harada M，Nose E，Takahashi N，et al.Evidence of the activation of unfolded protein response in granulosa and cumulus cells during follicular growth and maturation［J］.Gynecol Endocrinol，2015，31（10）：783-787.doi：10.3109/09513590.2015.1062862.

［11］McGee EA，Hsueh AJ.Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles［J］.Endocr Rev，2000，21（2）：200-214.doi:10.1210/edrv.21.2.0394.

［12］Hong IS，Cheung AP，Leung PC.Gonadotropin-releasing hormonesⅠ and Ⅱ induce apoptosis in human granulosa cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93（8）：3179-3185.doi：10.1210/jc.2008-0127.

［13］Tabas I，Rond.Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress［J］.Nat Cell Biol，2011，13（3）：184-190.doi：10.1038/ncb0311-184.

［14］Lin P，Yang Y，Li X，et al.Endoplasmic reticulum stress is involved in granulosa cell apoptosis during follicular atresia in goat ovaries［J］.Mol Reprod Dev，2012，79（6）：423-432.doi：10.1002/mrd.22045.

［15］Asselin E，Xiao CW，Wang YF，et al.Mammalian follicular development and atresia：role of apoptosis［J］.Biol Signals Recept，2000，9（2）：87-95.doi：10.1159/000014627.