磁分散固相萃取-高效液相色譜法測定牛奶中5種禁用喹諾酮類藥物

劉艷麗， 吳 昊， 杜曉慧， 馮藝洋， 趙雅妮， 常銀霞

(山西師范大學化學與材料科學學院,山西臨汾 041004)

喹諾酮類藥物(Quinolones,QNs)是一類重要的廣譜抗菌化合物，被廣泛用于人類和動物的傳染病治療[1 - 3]，其中一部分可被代謝和排泄掉，剩余的則殘留在人類和動物體中[4]。這些藥物殘留將會威脅到人類和動物的健康[5 - 7]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第2292號公告聲明，不允許洛美沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星用于食物源性動物的疾病治療。美國食品藥品監(jiān)督管理局也于2005年7月29日宣布禁止使用恩諾沙星進行家禽細菌感染的治療。但目前還沒有一種可以同時分析牛奶中上述5種禁用喹諾酮類藥物的方法。所以，建立一種可以同時對牛奶中這5種禁用痕量喹諾酮類藥物進行檢測的方法至關重要。

通常牛奶中QNs含量在痕量水平，因此需要對藥物進行預富集來降低牛奶中其他成分對藥物檢測的影響。常見的預富集方法有分散液-液微萃取[8]、固相萃取[9]、磁分散固相萃取[10]。對比這3種方法，由于磁分散固相萃取過程可以通過外加磁場分離磁性吸附劑與樣品溶液，所以磁固相萃取具有萃取過程簡單、耗時短、環(huán)境友好等優(yōu)勢。本文運用一步溶劑熱法合成了磁性還原氧化石墨烯材料(Fe3O4@RGO)，并用于萃取牛奶樣品中的喹諾酮類藥物，對影響萃取效率的因素,如樣品溶液的pH、吸附劑、解吸劑、吸附和解吸時間等進行了優(yōu)化。并結合高效液相色譜-熒光檢測器對牛奶中5種禁用喹諾酮類藥物進行了分析測定，獲得較好結果。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Waters 1525液相色譜儀(美國，Waters公司)，配1525雙泵系統(tǒng)和2475多波長熒光檢測器；KH 2200DV超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司)；pHS-3C酸度計(上海精科)。

洛美沙星(LOM)、諾氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFL)、培氟沙星(PEF)、恩諾沙星(ENR)標準品純度均在99.0%以上，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購得。其100 mg/L標準溶液由10 mg標準品溶于100 mL甲醇(色譜純)而得，冷藏于4 ℃?zhèn)溆谩? mg/L混合標準溶液由各標準溶液和色譜純的甲醇配制而成。

甲醇、乙腈為色譜純(北京百靈威科技有限公司)；H3PO4為色譜純(日本，Tokyo Chemical Industry公司)；FeCl3為優(yōu)級純(美國,Sigma公司)；乙二醇、乙醇、三乙胺、丙酮均為分析純(天津科密歐化學試劑有限公司)；乙二胺、NaAc為分析純(北京百靈威科技有限公司)。實驗用水由Milli-Q純水儀制備。

1.2 樣品預處理

樣品為從本地超市購買的牛奶。將1 mL牛奶樣品分散在5 mL乙腈中，以4 000 r/min離心15 min，然后把上清液轉移在干凈的棕色玻璃瓶中，并將其冷藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜條件

色譜柱：Gemini C18柱(250×4.6 mm,5 μm;廣州菲羅門)；柱溫箱：30 ℃；流動相：A相為乙腈，B相為0.25 mmol/L磷酸溶液(先用0.2 mol/L NaOH溶液調到pH=3.0，再用三乙胺調到pH=5.7)；洗脫條件：0～10 min，13%～20%B；10～20 min，20%～50%B；20～21 min，50%～13%B；21～30 min，13%B；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：激發(fā)和發(fā)射波長分別為272 nm和425 nm。

1.4 磁性材料的制備

制備了6種氧化石墨烯(GO)含量不同的磁性材料，制備方法如下：分別準確稱取0、75.00、115.74、156.48、197.22、237.96 mg GO于盛有25 mL乙二醇、750 mg FeCl3的燒杯中，磁力攪拌，然后加入1.2 g NaAc，繼續(xù)攪拌30 min，最后轉移到50 mL的聚四氟乙烯內膽中.于200 ℃反應12 h。所得磁性材料用無水乙醇和水洗滌數(shù)次，然后50 ℃下真空干燥10 h，分別標記為S1、S2、S3、S4、S5、S6。

1.5 萃取過程

首先往50 mL樣品溶液中加入適量磁性材料，超聲10 min使分析物與磁性材料充分接觸。之后用一塊磁鐵將磁性材料固定在比色管底部并倒掉上清液。然后加0.3 mL無水乙醇和0.1 mL pH=12.0的B-R緩沖溶液，超聲6 min分散磁性材料，再用小磁鐵收集磁性材料，用0.45 μm的微孔濾膜過濾解吸液，取10 μL注入高效液相色譜儀進行分析。

2 結果與討論

2.1 磁性材料的表征

用X-射線衍射、掃描電鏡和振動樣品磁強計對磁性材料進行了表征。X-射線衍射結果表明(圖略)所制備磁性材料，在(533)處有還原氧化石墨烯(RGO)的特征峰，在(220)、(311)、(400)、(422)、(440)、(511)有Fe3O4的特征峰；從掃描電鏡圖(圖1)可以看出Fe3O4納米顆粒的粒徑均勻，直徑約為30 nm，很好的負載在RGO上,隨著GO用量的增加，F(xiàn)e3O4在RGO上的分布越來越稀疏；磁滯曲線圖見圖2，結果表明磁性材料磁飽和值大于40 emu/g，說明所制備的磁性材料在外磁場的作用下很容易被分離。

圖1 S1、S2、S3、S4、S5和S6的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of S1，S2，S3，S4,S5 and S6

圖2 S1、S2、S3、S4、S5和S6的磁滯曲線Fig.2 Magnetization curves of S1，S2，S3，S4，S5 and S6

2.2 磁性材料用量的選擇

合適的吸附劑對吸附條件的優(yōu)化是至關重要的。我們研究了6種GO含量不同的磁性材料S1、S2、S3、S4、S5、S6，結果見圖2。由圖2可以看出，S3對諾氟沙星的萃取效果沒有S2好，但對其余4種禁用喹諾酮類藥物的萃取效果比另外的5種磁性材料均好。這可能是由于磁性材料對這幾種喹諾酮類藥物的萃取是Fe3O4與RGO的協(xié)同作用所致，當它們的量呈一定的比例時，磁性材料對藥物的萃取效果最佳，當Fe3O4或RGO任意一種含量增大都不利于對藥物的萃取。所以在接下來的實驗中均以磁性材料S3為吸附劑。

另外，在2～10 mg范圍內我們對磁性材料量的影響進行了研究。結果(圖3)顯示萃取效率隨著磁性材料用量的增加不斷增強，當磁性材料用量大于7 mg時萃取率開始緩慢下降，這可能是由于磁性材料過多未能完全分散在樣品溶液和解吸液中。因此，吸附劑的用量定為7 mg。

2.3 溶液pH的影響

溶液pH影響QNs的存在形式和磁性材料的表面電荷，對萃取效果產(chǎn)生顯著的影響。在pH=2.0～12.0范圍內研究了pH對萃取效率的影響，如圖4。結果表明在pH=2.0時可以獲得最大的萃取效率。水溶液中QNs的pKa值為5.66～8.56，表明水溶液中的QNs以陽離子、陰離子、中性分子形式存在[11 - 13]。所以，在pH=2.0時，QNs以陽離子形式存在。因此，較高的萃取效率可能是由于磁性材料表面含氧基團的負電荷與QNs所帶的正電荷之間的靜電作用。另外還研究了不同緩沖體系(乙酸鹽、檸檬酸鹽、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸鹽和三酸緩沖溶液)對萃取率的影響，結果表明三酸緩沖溶液(pH=2.0)萃取效果最佳。

圖3 磁性材料的選擇Fig.3 Selection of magnetic material

圖4 溶液pH的影響Fig.4 Effect of solution pH

2.4 解吸劑種類、體積和pH的影響

為了得到一個好的萃取率，選擇一個適當?shù)慕馕菏窍喈斨匾?。我們考察了甲醇、乙醇、丙酮、乙腈對萃取效果的影響，結果(圖5)表明4種溶劑均可將分析物從磁性材料上解吸下來，但乙醇的解吸效果最好。另外，我們在pH=2.0～12.0范圍內對解吸液的pH進行了研究。結果表明pH=2.0～6.0范圍內，隨著解吸液pH值的增大萃取率緩慢減?。籶H=6.0～12.0范圍內，隨著解吸液pH值的增大萃取率迅速增大，pH為12.0時，萃取率達到最大。所以解吸液的最佳pH值為12.0。同時，我們對解吸液中有機溶劑和緩沖溶液的體積比進行了優(yōu)化，結果表明最佳體積比為3∶1。

2.5 吸附與解吸時間的影響

為了評估吸附時間對萃取率的影響，在2～9 min的范圍內對吸附時間進行了研究。結果(圖6)表明，7 min時5種禁用喹諾酮類藥物都達到吸附平衡，因此吸附時間設定為7 min。同時，在1～8 min范圍內，研究了解吸時間對萃取率的影響，結果表明4 min為最佳的解吸時間。

2.6 磁性材料的回收利用

我們對磁性材料進行了回收利用。分析物從磁性材料上解吸下來后將磁性材料洗干凈并干燥，然后再進行吸附-解吸循環(huán)，結果發(fā)現(xiàn)第11次吸附-解吸后的萃取率與第1次的相比變化率小于5%，所以所制

圖5 解吸劑的選擇Fig.5 Selection of desorption solvent

圖6 吸附時間的影響Fig.6 Effect of extraction time

備的磁性材料具有良好的耐受度，可以重復使用10次，這極大的降低了樣品前處理成本。

2.7 方法分析性能

在最佳條件下對加標空白樣品進行分析，所建立方法性能參數(shù)列于表1。方法檢測限在1～4 ng/L之間，日間和日內相對標準偏差(RSD)都低于5%，說明此方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。同時也給出了富集倍數(shù)等參數(shù)，見表1。

表1 方法的性能參數(shù)

a：Extraction recovery;b：Enrichment factor.

2.8 樣品分析

用所建立的方法對3種牛奶樣品進行了分析，結果列于表2。這3種牛奶樣品中均無這5種禁用喹諾酮類藥物殘留。加標回收率在86.5%～104.1%之間，相對標準偏差小于5%，表明所建立的方法是檢測牛奶樣品中禁用喹諾酮類藥物殘留的有效方法。

表2 加標牛奶的測定

a:Not detected.

3 結論

提出磁固相萃取-高效液相色譜·熒光檢測方法，用于牛奶中禁用喹諾酮類藥物測定。Fe3O4@RGO作為吸附劑，避免了離心過程，大大地縮短了實驗時間。此方法具有較高的靈敏度。加標回收率為86.5%～104.1%，相對標準偏差小于5%，說明此方法可用于牛奶中5種禁用喹諾酮類藥物洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星的檢測。

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