微小RNA在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用

胡奕芳 郭 佳 綜述 劉章鎖 審校

糖尿病腎病(DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，在2015年，我國(guó)糖尿病相關(guān)的慢性腎臟病患者占總住院人口的1.10%，超過(guò)了原發(fā)性腎小球腎炎相關(guān)的慢性腎臟病患者(0.75%)，成為我國(guó)慢性腎臟病的主要病因之一[1]。在西方國(guó)家，DN是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的首要因素。隨著糖尿病發(fā)病率的劇增，DN導(dǎo)致的個(gè)人及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)十分沉重。但是，目前尚缺乏有效的早期診斷及治療手段，深入了解DN的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷及治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

DN的發(fā)病機(jī)制是多因素的，在高糖環(huán)境下，多種糖依賴途徑被激活，包括氧化應(yīng)激、腎臟多元醇的形成及晚期糖化終產(chǎn)物的累積等，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)因子、代謝因子及炎癥因子等，激活下游多種分子信號(hào)途徑[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類普遍存在的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約21～24個(gè)核苷酸，通過(guò)結(jié)合目的mRNA 3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)，阻滯蛋白翻譯或者誘導(dǎo)mRNA裂解，起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的作用[3]。1/3基因受miRNA調(diào)控[2]。miRNA在正常細(xì)胞的發(fā)展和代謝的重要性近些年才得以證實(shí)，其表達(dá)異常與一些重要的臨床疾病密切相關(guān)，從心肌梗死到腫瘤，以及DN等[4]，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本文將結(jié)合miRNA在DN中的最新研究成果，簡(jiǎn)述其在DN發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用，闡明miRNA作為DN診斷及治療靶向的前景，為后續(xù)研究拓展思路。

miRNA的生物合成

miRNA由基因組中某個(gè)基因座位作為獨(dú)立的非編碼基因，或者包含在編碼蛋白的內(nèi)含子中轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典的合成途徑是在核內(nèi)被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)鏈的原始miRNA，稱為pri-miRNA。pri-miRNA具有特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)短不一，可達(dá)幾千個(gè)堿基對(duì)。在RNA酶Ⅲ家族成員Drosha及其輔助蛋白DGCR8參與下，pri-miRNA 成為大約70～100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA前體，即pre-miRNA。pre-miRNA被Ran-GTP 依賴的雙鏈RNA結(jié)合蛋白——輸出蛋白 5(exportin 5)識(shí)別，從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，與RNA酶Ⅲ家族另一成員Dicer結(jié)合，被裂解為一個(gè)成熟的22個(gè)核苷酸的miRNA與miRNA*組成的雙鏈體，來(lái)自該雙鏈的成熟的miRNA摻入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA Induced silencing complex,RISC)發(fā)揮作用，miRNA*則被降解[3,5]。

在經(jīng)典途徑以外，Ruby等[5]在果蠅和線蟲中驗(yàn)證了另一種miRNA生物合成的途徑，在這一旁路途徑中某些內(nèi)含子模仿pre-miRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)入沒(méi)有Drosha介導(dǎo)的miRNA加工途徑，并將這些內(nèi)含子稱之為“mirtrons”。除mirtrons外，人類simtrons等不依賴經(jīng)典途徑中某些復(fù)合體的非經(jīng)典途徑逐漸被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)[6]。

miRNA參與DN的發(fā)病機(jī)制

腎臟病理生理改變DN的腎臟病理學(xué)改變主要包括腎小球肥大、基膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)堆積、系膜增生、足細(xì)胞損傷、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白質(zhì)滲透性增加等，最終導(dǎo)致蛋白尿、腎小球硬化等腎臟損傷。這一部分我們從腎組織纖維化、炎癥反應(yīng)和足細(xì)胞凋亡這三個(gè)主要的研究方向出發(fā)，總結(jié)miRNA在DN轉(zhuǎn)歸中的最新發(fā)現(xiàn)。

腎組織纖維化 腎組織纖維化在慢性腎臟病導(dǎo)致ESRD中起主導(dǎo)作用,阻斷纖維化的進(jìn)展是現(xiàn)今控制DN生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

高糖能夠誘導(dǎo)miR-27a的高表達(dá)，并通過(guò)結(jié)合過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)mRNA的3’-UTR，直接抑制PPARγ的表達(dá)，從而減少了PPARγ對(duì)纖維化的抑制作用，加快纖維化進(jìn)程[7]。McClelland等[8]在糖尿病小鼠及DN患者腎臟中發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)上調(diào)，且在病情進(jìn)展快的和纖維化程度高的DN患者腎穿刺活檢組織中miR-21的表達(dá)上調(diào)更為顯著。在阻斷近端腎小管上皮細(xì)胞(PTCs)SMAD3和Akt通路的情況下，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1( TGF-β1)和miR-21處理?xiàng)l件下的PTCs膠原蛋白等表達(dá)減少， 說(shuō)明miR-21參與了TGF-β1介導(dǎo)的SMAD3和Akt信號(hào)通路對(duì)膠原蛋白及纖維連接蛋白等促硬化作用的調(diào)控。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，是指上皮細(xì)胞在特定的生理或病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化為具有高遷移性和侵襲性的間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中，EMT的發(fā)生發(fā)展依賴于糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)的活動(dòng)及磷酸化，而在此過(guò)程中，miR-346通過(guò)抑制GSK3β的合成，抑制EMT[9]。Bai等[10]發(fā)現(xiàn)miR-130b在DN患者腎穿刺活檢組織中表達(dá)減少，miR-130b在大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)中通過(guò)抑制snail表達(dá)減輕EMT介導(dǎo)的纖維化。miR-23b在高糖誘導(dǎo)的人類PTCs和db/db小鼠腎組織中表達(dá)也降低，其直接作用于高遷移率蛋白A(HMGA)來(lái)抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt信號(hào)途徑的激活，從而抑制高糖誘導(dǎo)下DN中的EMT[11]。

炎癥反應(yīng) 炎癥機(jī)制在DN的發(fā)病機(jī)制中處于中心地位，其在DN中的作用解釋了代謝及血流動(dòng)力學(xué)的異常如何轉(zhuǎn)化為了腎臟功能及組織結(jié)構(gòu)的損傷，其中包含了復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，包括炎癥細(xì)胞、促炎因子、趨化因子及其受體和轉(zhuǎn)化因子等[12]。

在已有的報(bào)道中，miR-217在高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中通過(guò)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類1(Sirt1)/缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)信號(hào)途徑促進(jìn)炎癥及纖維化進(jìn)程[13]；miR-451能夠通過(guò)抑制大多功能蛋白酶7(LMP7)/核因子κB(NF-κB)活動(dòng)，從而下調(diào)促炎因子的表達(dá)，其表達(dá)增多還可減少db/db糖尿病小鼠微量白蛋白的排泄，降低血糖水平及腎小球損傷[14]。

而miR-146a卻具有抗炎及保護(hù)腎臟的獨(dú)特作用。miR-146a在STZ誘導(dǎo)的早期糖尿病小鼠腎臟及腹膜巨噬細(xì)胞中顯著高表達(dá)。miR-146a基因敲除的糖尿病小鼠白細(xì)胞介素1b(IL-1b)、MCP-1、CD11b等促炎因子表達(dá)增加，足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin表達(dá)減少，腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，抗炎型巨噬細(xì)胞表型(M2)與促炎型巨噬細(xì)胞表型(M1)比值減少，腎小球肥大，尿蛋白增多。miR-146a缺乏導(dǎo)致白介素1受體相關(guān)激酶1(Interleukin 1 receptor associated kinase 1，Irak1)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，Traf6)表達(dá)增加，激活下游NF-κB和Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與DN的進(jìn)展過(guò)程中的促炎作用[15]。該研究中還發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠建模16周時(shí)miR-146a的表達(dá)水平低于建模7周時(shí)，暗示著miR-146a隨著DN進(jìn)展，其保護(hù)作用是逐漸降低的，這就與Lee等[16]發(fā)現(xiàn)的T2DN患者及糖尿病小鼠模型中miR-146a表達(dá)水平降低相一致。

足細(xì)胞凋亡 足細(xì)胞是腎小球血液濾過(guò)屏障的重要組成部分，DN患者早期就表現(xiàn)出腎小球足細(xì)胞數(shù)目及其密度的減少,并隨著病變進(jìn)展愈發(fā)明顯，是DN發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志，足細(xì)胞病變不僅導(dǎo)致大量蛋白尿,而且還與腎小球硬化和腎功能損傷密切相關(guān)。

miR-218在高糖處理的足細(xì)胞中表達(dá)增加，通過(guò)直接下調(diào)血紅素氧合酶1(HO-1)及促進(jìn)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的激活引發(fā)足細(xì)胞凋亡[17]。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)高糖處理的足細(xì)胞中miR-34c的表達(dá)減少，其對(duì)Notch1/Jagged1信號(hào)通路的直接調(diào)節(jié)作用除了介導(dǎo)腎臟細(xì)胞的EMT外，miR-34c的過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)抑制Notch1/Jaggged1信號(hào)途徑，遏制高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞的凋亡。除此以外，Liu等[19]發(fā)現(xiàn)異黏蛋白(MTDH)可加強(qiáng)p38-MAPK介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，熒光素酶報(bào)告分析顯示miR-30家族為其上游直接調(diào)控者，miR-30家族通過(guò)減少M(fèi)TDH的表達(dá)，起到抑制高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞凋亡的作用。

miRNA通過(guò)多種信號(hào)途徑介導(dǎo)了DN的發(fā)生發(fā)展，糖尿病環(huán)境下其表達(dá)水平及功能各異。如前文所述，miR-27a、miR-21、miR-217等miRNA在高糖環(huán)境下表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了DN的腎臟損害；而miR-130b、miR-146a等隨病情進(jìn)展表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)這部分miRNA則會(huì)起到保護(hù)腎臟的作用。這些miRNA就很有可能成為潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

miRNA的單核苷酸多態(tài)性與DN 遺傳因素在糖尿病及DN的發(fā)生發(fā)展中有著舉足輕重的地位。miRNA基因中的單核苷酸多態(tài)性會(huì)影響成熟miRNA的表達(dá)水平及對(duì)靶mRNA的選擇，進(jìn)而干擾miRNA的正常功能，在一定程度上影響了DN的遺傳易感性。

let-7a-2基因調(diào)控區(qū)rs1143770的出現(xiàn)與DN的發(fā)生密切相關(guān)[20]。Li等[21]募集282例DN患者及312例糖尿病不伴腎病患者，結(jié)果顯示，存在于pre-miR-125a基因中rs12976445的出現(xiàn)在DN患者及糖尿病不伴腎病患者中存在明顯差異(OR 1.45,95%CI 1.02～2.08,P<0.05)，miR-125a在DN患者中的表達(dá)下調(diào)在一定程度上歸因于rs12976445基因多態(tài)性的出現(xiàn)。最近Kaidonis等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a中的rs2910164與1型糖尿病組中DN有顯著關(guān)聯(lián)(OR 1.93,95%CI 1.23～3.03,P=0.004)，而與2型糖尿病組中DN的關(guān)聯(lián)不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR 1.05,95%CI 0.83～1.32,P=0.691)。

DN中miRNA表觀遺傳修飾另一層面上，在DNA描繪的遺傳背景下，不改變基因序列的表觀遺傳調(diào)節(jié)造成的染色質(zhì)的修飾也有微小RNA的參與。

研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者miR-375啟動(dòng)子高甲基化可能參與miR-375表達(dá)調(diào)節(jié)和2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制[23]。Peng等[24]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)let-7a成員中僅let-7a-3的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)域包含CpG島，DN患者中l(wèi)et-7a-3表達(dá)下調(diào)，啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平升高，作用于泛素樣含PHD和環(huán)指域1及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，參與DN的自然進(jìn)程。小管細(xì)胞中miR-184表達(dá)水平受DNA去甲基化及組蛋白賴氨酸乙?；谋碛^調(diào)節(jié)，白蛋白超負(fù)荷能夠促進(jìn)組蛋白賴氨酸乙酰化水平，同時(shí)增加miR-184的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)F-κB的親和力，這些都導(dǎo)致miR-184的表達(dá)上調(diào)[25]。上述研究均暗示檢測(cè)及干預(yù)miRNA甲基化水平介導(dǎo)DN發(fā)生發(fā)展的可行性。

表觀遺傳修飾除了對(duì)miRNA本身表達(dá)水平的調(diào)節(jié)外，還可直接或者間接調(diào)節(jié)其他蛋白甲基化、乙酰化等過(guò)程。Siddiqi等[26]發(fā)現(xiàn)在高糖刺激的足細(xì)胞及糖尿病小鼠中，抑制miR-101可上調(diào)甲基化酶增強(qiáng)體(enhancer of zestehomolog 2,EZH2)的表達(dá)，減少內(nèi)源性抗氧化抑制物硫氧還原蛋白結(jié)合蛋白(thioredoxin interacting protein,TxnIP)，減輕氧化應(yīng)激作用。高血糖還可以通過(guò)降低miR-29a的表達(dá)加強(qiáng)去乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)的活動(dòng)，使足細(xì)胞標(biāo)記蛋白去乙酰化，導(dǎo)致腎功能損害；反之，HDAC4通過(guò)去乙?；嚢彼?的組蛋白H3(histone H3 at lysine 9,H3K9)，降低miR-29a表達(dá)[27](表1)。

表1 微小RNA(miRNA)參與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制

PPARγ：過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ；PTEN：磷酸酶及張力蛋白同源體；Sirt1： 沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類1; HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子1α；HO-1： 血紅素氧合酶1; p38-MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；LPP3；磷酸酯磷酸酶3；SOCS1：細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；Cdc25a：細(xì)胞分裂周期蛋白25a；Cdk6：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6；GSK3β：糖原合成酶激酶3β；HMGA：高遷移率蛋白A；PI3K：磷脂酰肌醇3激酶； LMP7：大多功能蛋白酶7; NF-κB：核因子κB；Irak1：白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1；Traf6：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6；ErbB4：表皮生長(zhǎng)因子4； MTDH：異黏蛋白； EZH2：甲基化酶增強(qiáng)體；TxnIP：硫氧還原蛋白結(jié)合蛋白；HDAC4：去乙酰酶4

循環(huán)miRNA與DN早期診斷

DN起病隱匿，進(jìn)展緩慢，腎活檢率低。非侵襲性檢查可連續(xù)性監(jiān)測(cè)DN的疾病進(jìn)程，但是基于蛋白尿、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病的罹病時(shí)間等對(duì)其的初步診斷存在局限性，很難區(qū)分是否為DN，導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)早期正確干預(yù)腎臟疾病的最佳時(shí)機(jī)，亟待無(wú)創(chuàng)或半無(wú)創(chuàng)前提下早期更有效診斷DN的方法。

miRNA的可探測(cè)性和穩(wěn)定性為其成為生物學(xué)檢測(cè)新指標(biāo)的可能提供了依據(jù)。miRNA在多種體液中均可測(cè)出，通過(guò)與體液中高分子復(fù)合物結(jié)合或者存在于外泌體中等方式，保持其高度穩(wěn)定性。有報(bào)道將尿液置于例如高RNA酶、過(guò)高或過(guò)低pH、長(zhǎng)時(shí)間室溫儲(chǔ)存或者反復(fù)凍融多達(dá)10次的極端條件下，miRNA水平保持穩(wěn)定或者僅一定程度降解[30]。

外泌體是由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜性小泡，運(yùn)載mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)等參與細(xì)胞與細(xì)胞間的交流，為腎臟病的研究帶來(lái)了極大的發(fā)展前景。近來(lái)一項(xiàng)包含156例T2DN患者的生物信息學(xué)及臨床驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，尿液外泌體中miR-133b、miR-342和miR-30a在T2DN患者中表達(dá)水平相較于正常人顯著增高(P<0.001)，且與尿蛋白排泄率、血清肌酐及eGFR高度相關(guān)，探測(cè)DN敏感度及特異度較高[31]。miR-133b、miR-342和miR-30a在糖尿病腎病正常蛋白尿組(UACR<30 mg/g)的陽(yáng)性檢測(cè)率分別是39.3%、19.6% 和17.9% ，表明在這些患者中分子水平的改變要先于蛋白尿的發(fā)生，這組微小RNA在DN早期診斷、預(yù)后及治療方面具有潛在價(jià)值。Mohan等[32]發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠模型的尿外泌體中miR-451-5p、miR-16表達(dá)水平顯著增高，早期尿蛋白量及腎小管纖維化指數(shù)、腎小球硬化指數(shù)均無(wú)明顯變化時(shí)，尿外泌體中特別是miR-451-5p的表達(dá)上調(diào)已具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且可預(yù)示后期尿蛋白量的上升和腎組織病理學(xué)改變，具有監(jiān)測(cè)DN進(jìn)展的潛在價(jià)值。但miR-451-5p、miR-16在糖尿病大鼠腎臟組織中表達(dá)卻是顯著減少的，暗示其或許對(duì)腎臟組織起保護(hù)作用。從另一角度看，外泌體與腎組織中miRNA表達(dá)水平的不一致，為后續(xù)研究帶來(lái)了新的思路。尿液外泌體在DN循環(huán)miRNA的研究中是一大熱點(diǎn)。

但是，當(dāng)前外泌體的研究存在很多局限性，包括外泌體的分離純化、鑒別及其包含成分的定量和校正等存在爭(zhēng)議，亟待新技術(shù)及新思路的突破。

與此同時(shí)，血清中miRNA的差異表達(dá)也頗受關(guān)注。歐洲一項(xiàng)納入455例1型糖尿病患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-126與1型糖尿病血管并發(fā)癥呈負(fù)相關(guān)，尤其能降低增殖性腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)[33]。Higuchi等[34]在糖尿病小鼠及T2DN患者血清中發(fā)現(xiàn)了miR-101、miR-375和miR-802等miRNA水平顯著升高，與腎功能、糖化血紅蛋白等指標(biāo)密切相關(guān)，需進(jìn)一步研究其機(jī)制及生物標(biāo)記價(jià)值。T2DN患者血清中miR-130b表達(dá)水平明顯降低，伴隨著蛋白尿、空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、血清肌酐等臨床指標(biāo)的相關(guān)改變[35]。

循環(huán)miRNA在DN患者中的研究?jī)H限于發(fā)現(xiàn)問(wèn)題階段，其主要機(jī)制、干擾因素、表達(dá)水平處于何種范圍內(nèi)具有診斷及預(yù)測(cè)意義等尚無(wú)法得知，亟待進(jìn)一步研究分析。

miRNA的研究前景

近年來(lái)，關(guān)于miRNA的研究逐漸增多，其在病理生理等方面的重要作用及主要機(jī)制逐漸被揭露。與DN相關(guān)的miRNA數(shù)目繁多，涉及的信號(hào)通路更是錯(cuò)綜復(fù)雜，miRNA之間的內(nèi)在聯(lián)系有待明確。此外，miRNA在DN進(jìn)展的不同時(shí)期其作用和表達(dá)水平存在動(dòng)態(tài)性變化，表達(dá)譜具有組織特異性。

將miRNA的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)對(duì)我們尋找新的診療靶點(diǎn)有很好的啟示作用。已有報(bào)道中，研究者抑制或者上調(diào)miRNA的表達(dá)，或者作用于miRNA作用通路的任一環(huán)節(jié)，對(duì)DN的轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生了顯著影響，這提供了大量基于miRNA的精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)。但是，組織的纖維化、炎癥等病理生理改變參與很多疾病的發(fā)生發(fā)展，這就導(dǎo)致涉及這些過(guò)程的miRNA診斷及治療疾病的特異度降低，有必要進(jìn)一步研究篩查。

小結(jié)：miRNA在DN的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位，其不僅能參與和促進(jìn)疾病的進(jìn)展，也能對(duì)腎臟起到保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究提供了新的依據(jù)，也為臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供了新的生物標(biāo)志物。不可否認(rèn)，miRNA在DN中的研究及臨床應(yīng)用仍面臨極大的挑戰(zhàn)。

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