聯(lián)合化療與光動力治療于一體的水溶性銅ギ、鎳ギ酞菁的合成及體外抗癌活性

潘佳寶 陳 曦 方文娟 劉 偉 于光偉

(山東大學晶體材料國家重點實驗室，濟南 250100)

0 引 言

當今，集多效于一體的抗癌藥物是現(xiàn)代腫瘤治療的新興研究熱點。 通過將不同治療機理應用到同一藥物中，可以發(fā)揮不同治療手段的協(xié)同作用，從而達到高效抗癌活性[1-6]。

光動力治療(photodynamic therapy，PDT)是一種20世紀70年代發(fā)展起來的癌癥治療手段，它利用光激發(fā)癌細胞內部吸收的光敏劑，產生高細胞毒性的單線態(tài)氧，從而在細胞內部殺死癌細胞，以達到治療腫瘤目的[7-8]。與傳統(tǒng)癌癥治療手段相比，這種療法可以避免對正常組織造成傷害，且不會在體內積累，可以反復治療，并能與其他療法同時使用。PDT光敏劑中，酞菁由于其理化性質穩(wěn)定，在紅光有強吸收，單線態(tài)產率高以及皮膚光敏作用短等特點，是繼臨床應用最廣泛的卟啉類光敏劑之后最具有應用潛力的新生代光敏劑之一[9-11]。其中，部分酞菁類配合物已經應用到一期和二期臨床試驗中，并表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。

另一方面，自從20世紀60年代末順鉑被發(fā)現(xiàn)具有良好的腫瘤抑制作用以來，基于金屬配合物的抗癌藥物的研究日益引起人們的重視。近年來眾多研究結果已證實銅、鎳、鍺、鉬、鈀、鎳等金屬及其配合物同樣具有良好的抗腫瘤、抗菌等活性[12-14]。其中，銅和鎳作為生命必須微量元素，參與到多項生命活動中，扮演著重要的角色。因此，關于銅和鎳配合物的抗菌及抗癌活性的研究已經成為抗腫瘤藥物的研究重點之一，并逐漸吸引愈來愈多的藥物工作者的研究興趣。但是，迄今為止，關于酞菁類抗癌藥物的研究主要集中在鋅、硅等酞菁上，對于銅、鎳、鍺、鉬、鈀、鎳等過渡金屬酞菁的抗癌活性的研究至今鮮見報道[15]。

鑒于銅、鎳金屬配合物的抗菌和抗腫瘤效應，我們首次合成水溶性銅(CuPc)、鎳酞菁(NiPc)配合物，在對其進行了表征的基礎上研究了其光化學物理特性以及對腫瘤細胞殺傷力。以期將金屬配合物的抗癌活性與光動力治療特性相結合，得到集多效為一體的抗癌藥物。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所用儀器有：Bruker AVANCE 300 MHz核磁共振儀；Thermo NEXUS 670 IR Spectrometer紅外光譜儀；Vario EIⅢ元素分析儀；PerkinElmer Diamond TG/DTA Analyzer熱重分析；Perkin Elmer Lambda 35紫外-可見光譜儀；Shimadzu AXIMA-CFR PLUS質譜儀；Bio-TEK ELX 800 microplate reader酶標儀。

實驗中所用試劑均為分析純，反應中所有溶劑都按照溶劑手冊進行蒸餾除水。

1.2 合 成

1.2.1 前置配體3的合成[16]

稱取 4，5-二氯鄰苯二腈(2.0 g，10.2 mmol),與 5-羥基間苯二甲酸甲酯(4.3 g，20.4 mmol)混合、加入碳酸鉀(16.6 g，0.12 mol)、DMF(45 mL)，65 ℃條件下反應16 h。減壓抽干DMF，加水過濾得淺棕色固體。將粗產物在甲醇中重結晶，真空干燥，得到白色固體即為化合物 3。1H NMR(300 MHz，CDCl3，TMS)：δ 8.56 ～8.55(br，2H，Ar-H)，7.83 ～7.82(br，4H，Ar-H)，7.33～7.26(br，2H，Ar-H)，3.97(s，12H，CH3)。

1.2.2 銅酞菁4的合成

將化合物 3(0.52 g，0.96 mmol)、100 μL 的 DBU、10 mL正戊醇混合，升溫至150℃，氮氣保護下反應15 h，得到墨綠色溶液后，往體系中加入乙酸銅(0.85 g，4.40 mmol)，5 h后停止反應。減壓蒸餾，60 ℃條件下抽干戊醇。加入適量甲醇超聲后，過濾得到綠色固體，將得到的固體使用硅膠柱進行柱色譜分離提純，洗脫劑為氯仿+乙酸乙酯(20∶1，V/V)。 得到銅酞菁 4為 255 mg， 產率為 34%。MALDI-TOF/MS：C176H208N8O40Cu[M+]，m/z： 計算值 3 136.37，實驗值3 136.61。元素分析按C176H208N8O40Cu計算值(%)：C 67.34；H，6.68 N，3.57；實驗值(%)：C 67.1；H 6.0；N 3.1；UV-Vis(CHCl3，λmax/nm)：344，610，646，677。

1.2.3 鎳酞菁5的合成

將化合物 3(0.52 g，0.96 mmol)、乙酸鎳(0.08 g，0.45 mmol)混合，加入 100 μL的 DBU和 10 mL正戊醇，氮氣保護下升溫至150℃反應10 h。反應結束后進行減壓蒸餾，60℃ 條件下抽干戊醇，在反應瓶中加滿甲醇，超聲過濾，收集到的濾渣，以氯仿+乙酸乙酯(10∶1,V/V)為洗脫劑進行柱色譜分離提純。得到綠色固體5為304 mg，產率為40%。1H NMR(300 MHz，CDCl3，TMS)：δ 8.60(s，8H,Ar-H),8.15(s,8H,Ar-H)，7.99(s,16H，Ar-H),4.19(m 32H,16OCH2),1.69～1.65(m，32H，16CH2)，1.31～1.20(m，64H，16CH2CH2)，0.76～0.73(t，J=5.3 Hz,48H,16CH3)；MALDI-TOF/MS：C176H208N8O40Ni[M+]，m/z： 計算值 3 131.38， 實驗值3 131.39；元素分析按 C176H208N8O40Ni計算值(%)：C 67.4，H 6.7，N 3.4；實驗值：C 67.6，H 6.7，N 3.4；UVVis(CHCl3，λmax/nm)：297，603，641，667。

1.2.4 水溶性銅酞菁6和鎳酞菁7的合成

Scheme 1

按照甲醇+水 (10∶1，V/V)的比例配制溶液400 mL，往其中加入50.0 g氫氧化鈉配成飽和氫氧化鈉溶液。將配好的飽和溶液轉移到反應釜中，將CuPc 4或者NiPc 5(0.10 mmol)用少量THF(5 mL)溶解，逐滴加入到上述的堿溶液中，攪拌升溫至 45℃，氮氣保護下反應6 h。反應結束后過濾，粗產物用100 mL去離子水溶解后用1 mol·L-1的稀鹽酸溶液調節(jié)pH值為2～3，溶液中有大量藍色沉淀出現(xiàn)，將得到的沉淀離心收集，用水反復沖洗。真空下除去殘留的溶劑，得到目標產物。CuPc 6：MALDI-TOF/MS：C96H48N8O40Cu[M+H+]，m/z：計算值 2 016.13，實驗值2 016.51；IR(cm-1)：2 918，2 805，2 567，1 699,1 591,1 508，1 455，1 407，1 273,1 221,1 173,1 144,1 092,1 042，1 001，971，892，827，759，747，667；元素分析按 C96H48N8O40Cu 計算值(%)：C 57.2，H 2.4，N 5.6；實驗值：C 59.6,H 2.2,N 5.3;UV-Vis(DMF，λmax/nm):351,612，647，685。 NiPc 7：1H NMR(400 MHz，DMSO-d6，TMS)：δ 13.04(br，16H，COOH)，8.63(s，8H，Ar-H),7.97(s,8H,Ar-H),7.84(s,16H,Ar-H);MALDI-TOF/MS：C96H48N8O40Ni[M+H+],m/z:計算值2 011.13,實驗值2 011.32;IR(cm-1)：3 076,2 607,1 706,1 593,1 536,1 458,1 417,1 354,1 278,1 147,1 094,1 054，1 001，973，887，831，753，668； 元素分析按 C96H48N8O40Ni計算值 (%)：C 57.30，H 2.40，N 5.57； 實驗值 (%)：C 57.6，H 2.1，N 5.5。UV-Vis(DMF，λmax/nm)：303，608，645，672 nm。

1.3 單線態(tài)氧測試

以1，3二苯基異苯并呋喃(DPBF)為單線態(tài)氧捕獲劑，光源使用150 W配有610 nm截止型濾波片(λ＞610 nm)的鹵素燈。以30 s為一個時間間隔使用光源照射，記錄溶液的紫外可見光譜。單線態(tài)氧量子產率計算公式如下：

其中，KDPBF,sample和KDPBF,ZnPc分別為樣品和ZnPc存在時DPBF分解速率常數(shù)，Asample和AZnPc分別為樣品和ZnPc在610～720 nm波長范圍內的Q帶吸收峰的面積，ΦΔ,ZnPc=0.56。

1.4 生物測試

1.4.1 細胞培養(yǎng)條件

實驗所用細胞為宮頸癌細胞Hela，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)環(huán)境為溫度37℃，5%(V/V)二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基使用添加了10%小牛血清和1%雙抗(青霉素 100 units·mL-1，鏈霉素 100 μg·mL-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基。使用細胞計數(shù)板對培養(yǎng)基中的細胞進行計數(shù)，使得培養(yǎng)基中細胞濃度105mL-1。取培養(yǎng)基加入96孔板，每孔100 μL，將加好細胞的孔板放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

1.4.2 抗癌活性實驗

合成的CuPc 6和NiPc 7酞菁樣品溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中配制成母液，然后用細胞培養(yǎng)液稀釋到所需要的濃度。金屬鹽對比組CuCl2、NiCl2溶于PBS中。不同濃度的樣品在96孔培養(yǎng)板中與細胞共同培養(yǎng)4 h、24 h后移除，以PBS洗細胞3次，光照組加入培養(yǎng)基后用LED光源連續(xù)照射20 min(總能量24 J·cm-2)，然后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h；避光組、金屬鹽對照組除光照外，其他步驟相同。最后，每孔中加入 20 μL 濃度 5 mg·mL-1MTT 的 PBS，再次恒溫培養(yǎng)4 h后，每孔加入200 μL DMSO，在水平搖床上晃動20 min。使用酶標儀測試孔板在492 nm處的吸光度。作圖并計算細胞的成活率。1.4.3 細胞吸收實驗

將培養(yǎng)好的Hela細胞利用細胞計數(shù)板對培養(yǎng)基中細胞進行計數(shù)，使培養(yǎng)基中的細胞數(shù)目約為3×104mL-1。稀釋好的細胞液加入直徑為35 mm的6孔板中，每孔加1 mL，每個樣品平行培養(yǎng)3組作為平行實驗。接著將孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使得細胞貼壁。將細胞完全貼壁的孔板取出，吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入含樣品 (濃度為10 μmol·L-1)的培養(yǎng)基 1 mL，恒溫培養(yǎng)4 h。 取出孔板，吸出其中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，利用細胞刮板將細胞小心刮起，分別轉移到2 mL的離心管中冷凍干燥。細胞液凍干后，向每個離心管中加入DMF溶液400 μL，超聲30 min。隨后用離心機離心，設置轉速13 000 r·min-1離心4 min，將細胞器以及細胞碎片完全除去，隨后測定上清液的紫外吸收光譜并計算細胞中樣品的含量。

2 結果與討論

2.1 合 成

通過在酞菁骨架上引入水溶性基團，可以減弱酞菁分子間的π-π相互作用，有效改善溶解性能。本文首先以金屬鹽為模板，通過配體4，5-(3，5二甲氧基羰基)苯氧基鄰苯二腈3的對稱合成得到金屬酞菁。在合成CuPc 4時發(fā)現(xiàn)，不同于以往配體、DBU、溶劑、金屬鹽同時加入的模板反應，銅酞菁的產率極低。然后，我們將反應步驟改為在無金屬鹽存在下，以前置配體、DBU、溶劑先合成非金屬酞菁，然后再加入金屬鹽合成金屬酞菁，這種方法較大地提高了銅酞菁的純度和產率。 分析原因為，前置配體3中的大量酯基會參與到Cuギ的配位中，從而影響到銅離子的模板的作用，降低了前置配體的成環(huán)率。然而，同樣的情況下，在鎳酞菁5的合成過程中，同時加入原料、催化劑和金屬鹽，對鎳酞菁的成環(huán)率影響不大。

水溶性酞菁的合成則是分別以銅酞菁4和鎳酞菁5原料，在強堿性條件下發(fā)生水解反應，粗產物再用鹽酸調節(jié)pH值為2～3，由于羧基在酸性溶液中被質子化，從而從水中沉淀出來，最后得到CuPc 6 和 NiPc 7(Scheme 1)。

2.2 紫外-可見光譜分析

圖1為未水解的CuPc 4和NiPc 5在CHCl3溶液中和水解后CuPc 6和NiPc 7在水中的紫外可見吸收譜圖對比?？梢钥闯?，6在水中與4在CHCl3中表現(xiàn)出相似的峰型，為非常典型的酞菁非聚集態(tài)譜圖(圖1a)[8-9]，證明其能夠在無任何助溶劑存在下就能以單體的形式存在，是一類全水溶性酞菁。銅酞菁4和6的B帶吸收峰分別位于344和351 nm，Q帶吸收峰位于677和685 nm，顯示水解后酞菁6在水中的吸收峰具有約10 nm的紅移。鎳酞菁相比較于銅酞菁，其吸收峰值發(fā)生了一定量的藍移。鎳酞菁5和7的B帶吸收峰位都位于300 nm，Q帶吸收峰分別位于668和672 nm(圖1b)，顯示水解后的鎳酞菁在水中的吸收峰同樣發(fā)生紅移。與銅酞菁6一樣，鎳酞菁7在水中同樣以單體形式存在，是一類水溶性酞菁。而生物所用的培養(yǎng)液與生理環(huán)境相匹配,其pH=7.4，在該pH值下，酞菁上的羧基被水解成為羧酸根，所以該類酞菁具有優(yōu)異的水溶性。

另外，濃度-吸收關系測試說明，CuPc 6和NiPc 7溶液的吸光度與樣品濃度滿足朗伯-比爾定律(圖2)，所以在細胞吸收實驗中我們可以依據(jù)該線性關系，通過吸收值來確定細胞對的樣品的吸收。

圖1 (a)水解前銅酞菁4和水解后銅酞菁6的紫外光譜;(b)水解前鎳酞菁5和水解后鎳酞菁7的紫外光譜Fig.1 (a)UV-Vis absorption spectra of CuPc 4 and 6;(b)UV-Vis absorption spectra of NiPc 5 and 7

圖2 銅酞菁6(a)和鎳酞菁7(b)在DMF中的紫外吸收光譜Fig.2 Electronic absorption spectra of CuPc 6(a)and NiPc 7(b)in DMF

2.3 單線態(tài)氧測試

將 DPBF 配制成濃度為 40 μmol·L-1的 DMF 溶液，分別加入樣品CuPc 6或NiPc 7，使酞菁最終濃度為 5 μmol·L-1，以 30 s為一個時間間隔使用光源照射，測試溶液的紫外可見光譜。如圖3所示，隨著光照時間的延長溶液中DPBF吸收峰逐漸減小，而酞菁的吸收峰沒有明顯的變化，這說明在這一光照條件下，銅酞菁都能夠有效產生單線態(tài)氧，同時自身不會分解。圖4為銅酞菁6和鎳酞菁7單線態(tài)氧產率比較，從圖中可以看出，CuPc 6的單線態(tài)氧產率明顯高于NiPc 7。

圖4 DPBF在CuPc 6或NiPc 7存在時吸收峰值(415 nm)隨時間的變化Fig.4 Absorbance of DPBF(415 nm)changes over time in the presence of CuPc 6 or NiPc 7

圖3 單線態(tài)氧測試過程中DPBF中加入CuPc 6時吸收峰隨光照時間的變化Fig.3 Absorption changes of DPBFupon exposure to red light in the presence of CuPc 6 for determination of singlet oxygen generation

2.4 穩(wěn)定性測試

2.4.1 光穩(wěn)定性測試

在光照下酞菁如果能保持自身結構的完整性，具有良好的穩(wěn)定性，那么在光動力治療過程中酞菁就不發(fā)生分解，保證藥物作用的持續(xù)性，所以光穩(wěn)定性是光敏劑的重要指標之一。將CuPc 6、NiPc 7和ZnPc分別溶于DMF中，使用配有610 nm截止型濾波片(λ＞610 nm)的鹵素燈光源進行測試。每隔10 min測定酞菁溶液的吸光度的變化，以ZnPc作為對照組，可以判斷CuPc 6和NiPc 7兩種樣品的光穩(wěn)定性。測試結果表明，在相同的實驗條件下，用來作為對比的ZnPc隨著光照時間的延長大量分解，60 min時已經分解50%，而合成的CuPc 6和NiPc 7在光照60 min后沒有明顯分解，具有更強的光穩(wěn)定性(圖5)。

2.4.2 熱穩(wěn)定性測試

為了分析該類酞菁的熱穩(wěn)定性，我們對其做了熱重分析。以銅酞菁為例，水解前和水解后的銅酞菁熱重曲線如圖6所示?？梢钥闯?，銅酞菁4由于大量烷基碳鏈的存在，開始分解溫度大約為370℃。對于水解后的銅酞菁6，在400℃以后才開始分解，比銅酞菁4初始分解溫度有提高?？偟膩碚f，該類酞菁對熱是十分穩(wěn)定的。

圖5 銅酞菁6(a)和鎳酞菁7(b)在DMF溶液中不同光照時間下的紫外可見光譜圖Fig.5 UV-Vis absorption spectra of CuPc 6(a)and NiPc 7(b)under different illumination times in DMF

圖6 銅酞菁4(a)與6(b)和鎳酞菁5(c)與7(d)的熱重分析(TG-DTA)曲線Fig.6 TG-DTA curves of CuPc 4(a),6(b)and NiPc 5(c),7(d)

2.5 細胞實驗

2.5.1 避光腫瘤細胞抑制測試

在該部分實驗中選用了宮頸癌細胞Hela作為細胞主體。為了更好的比較該類銅酞菁6和鎳酞菁7對癌細胞的抑制作用，同時測試了銅離子(Cu2+)和鎳離子(Ni2+)對hela細胞的毒性。從圖7a可以看出，銅離子(Cu2+)和鎳離子(Ni2+)樣品與細胞共同培養(yǎng)時間為 4 h 后，即使?jié)舛冗_到 50 μmol·L-1，2 種金屬離子對于癌細胞抑制效果仍然很微弱。這主要是由于在生理pH=7.4下，銅和鎳離子都幾乎以沉淀形式析出，所以直接利用金屬離子進行抗癌是不可行的。與之對比，2種酞菁的金屬配合物表現(xiàn)出隨濃度增加而增強的腫瘤細胞抑制作用。從圖中可以看出24 h 培養(yǎng)后，銅酞菁 6 的 IC50值為 23.31 μmol·L-1，鎳酞菁 7 的 IC50值為 19.73 μmol·L-1， 類似于文獻報道聯(lián)吡啶類和甲醛縮氨基硫脲銅、鎳配合物48 h的細胞實驗數(shù)據(jù)[17-18]。證實本文合成的金屬酞菁類化合物具有良好抗腫瘤活性。這從另一方面也可以說明，銅鎳離子與酞菁形成的配合物不僅水溶性好、生物相容性高，而且更有利于腫瘤細胞的吸收，從而表現(xiàn)出對腫瘤細胞良好的抑制效果。

圖7 (a)銅、鎳離子和(b)銅、鎳酞菁配合物6、7對Hela細胞的濃度-抑制關系曲線Fig.7 Comparison of cytotoxic effect of Cu2+,Ni2+(a)and CuPc 6,NiPc 7(b)towards Hela cells

2.5.2 光照下腫瘤細胞抑制測試

為了有效地顯示該類銅、鎳酞菁對腫瘤細胞的抑制作用和光動力治療的聯(lián)合效應，測試了光照條件下銅酞菁6和鎳酞菁7對癌細胞的抑制作用。從圖8可以看出，培養(yǎng)4 h后，銅、鎳酞菁在避光條件下的細胞抑制作用依然表現(xiàn)出隨濃度增加而增強的腫瘤細胞抑制作用。只是與培養(yǎng)24 h的結果相比，CuPc 6和NiPc 7的IC50值均顯著提升。表明避光下，銅、鎳酞菁的細胞的抑制作用與培養(yǎng)時間同樣具有依賴關系。所以，延長培養(yǎng)時間是提高該類配合物腫瘤細胞抑制作用的有效途徑。

在共同培養(yǎng)4 h后，樣品被移除，以PBS洗細胞3次，光照組加入培養(yǎng)基后用660 nm LED光源連續(xù)照射20 min。當在紅光的照射下，2種樣品表現(xiàn)出相應的光毒性，較低濃度下均能有效殺死細胞，20 μmol·L-1時CuPc 6和NiPc 7均能夠殺死70%左右的腫瘤細胞。光照下，CuPc 6 的 IC50為 14.9 μmol·L-1，NiPc 7 的 IC50值為 18.5 μmol·L-1，與避光 IC50相比，均表現(xiàn)出了顯著的降低。同時，該數(shù)值同樣低于避光下24 h的暗毒性的IC50結果。所以，光照能明顯提升銅、鎳酞菁殺死癌細胞的能力，說明該類化合物具有化療與光動力治療抗癌的協(xié)同作用。

需要提及的是，從前面的單線態(tài)氧測試數(shù)據(jù)上看，鎳酞菁的單線態(tài)氧產率明顯小于銅酞菁。但是光照實驗卻表明在相同的培養(yǎng)濃度下，它們卻具有很相近的光動力治療效果。因此，對該類銅、鎳酞菁在細胞中的吸收進行了對比。測試結果表明，Hela細胞對NiPc 7的吸收量明顯高于CuPc 6，前者約為后者的3倍，這可能是鎳酞菁具有良好的光動力治療效應的一個原因。

圖8 不同濃度下的 CuPc 6(a)和NiPc 7(b)在光照(☆)和避光(★)條件下對Hela細胞的毒性Fig.8 Comparison of cytotoxic effect of CuPc 6(a)and NiPc 7(b)toward Hela cells in the presence(☆)and absence(★)of light

3 結 論

以鄰苯二腈法合成了全水溶性銅酞菁6與鎳酞菁7。由于銅ギ與前置配體中的酯基有較強的配位作用，先加入前置配體和催化劑待其反應成環(huán)后，再加入金屬鹽，是提高銅酞菁的純度和產率的有效方法。同樣的情況下，加料順序對鎳酞菁的成環(huán)反應影響較小。

銅酞菁6與鎳酞菁7在水溶液中能夠以單體形式存在，水溶性好、生物相容性好，并具有很強的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。單線態(tài)氧測試結果表示銅酞菁6與鎳酞菁7均能有效的產生單線態(tài)氧，其中銅酞菁的單線態(tài)氧產率明顯高于鎳酞菁。細胞實驗顯示，銅酞菁6與鎳酞菁7在避光下均表現(xiàn)出對腫瘤細胞的有效抑制作用。同時光照條件下IC50值明顯小于避光條件，這說明銅酞菁6與鎳酞菁7表現(xiàn)出較強的光動力治療效果，進一步證實合成的金屬酞菁具有化療-光動力治療協(xié)同作用，是一類具有潛在應用價值的多功效抗癌藥物。

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