接觸性檢材的DNA自動化提取

王穎希，張慶霞，薛盧艷，李 程，杜 娟，霍振義，焦章平

（北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

案件接觸性檢材主要指人體與物體接觸所遺留的表皮脫落細胞（下文簡稱脫落細胞），故嫌疑人使用的工具、戴過的手套、遺留的指紋等都可能含有不同數(shù)量的脫落細胞。接觸性檢材的DNA含量微，降解程度高，目前公安DNA實驗室主要以磁珠法提取，工作量大、耗時長。但接觸性檢材數(shù)量卻日益增多，而對檢驗時間的要求越來越迫切，故DNA檢驗工作的壓力越來越大[1-3]。DNA提取是檢驗的關(guān)鍵，獲得的DNA模板質(zhì)量直接影響著后續(xù)實驗。自動化工作站提取方式具有高通量批量處理功能，可有效提升檢材處理效率，降低勞動強度[4]。但以往的自動化提取方法對微量DNA的提取能力存在不足，能否適用于批量處理接觸性檢材還需進一步改進和驗證[5,8]。本文以KingFisher磁珠純化儀結(jié)合超微量磁珠法提取試劑盒，建立了自動、高通量提取接觸性檢材DNA的新方法。測試結(jié)果顯示該方法適用檢材范圍廣，樣品處理效率高，DNA有效檢出率達71.5%，效果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

標(biāo)準(zhǔn)品 2800 M（濃度：10 ng/μ L，promega公司）；自制指紋樣本，7人的食指、中指、無名指分別在載玻片上各按一枚指紋，力度適中，按壓時間5 s左右，共21枚指紋樣本。本實驗室日常案件送檢的接觸性檢材（均為棉簽擦拭脫落細胞或脫落細胞粘取器粘取的脫落細胞，如窗框拭子、作案工具拭子、嫌疑人遺留現(xiàn)場物品的粘取物等），共計870份，檢材未做區(qū)分。KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)（低通量版及高通量版）（博坤生物公司）、ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（博坤生物公司）、ProFlex? PCR系統(tǒng)（Thermo公司）、3500xL基因分析儀（ABI公司）、ID Plus擴增試劑盒（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取

不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA的回收實驗。取DNA標(biāo)準(zhǔn)品 2800M（10 ng/μ L）5μ L 加入到 495 μ L 高純水中，稀釋成0.1 ng/μ L的純DNA標(biāo)準(zhǔn)品；分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5 μ L稀釋后樣本，使用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒對其消化，進行0.1、0.15、0.2、0.25 ng純DNA回收實驗，洗脫體積為30 μ L，每個濃度平行進行10次試驗。將預(yù)處理后的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)（低通量版，24道）進行自動化DNA提取。

單枚指紋DNA提取實驗。利用擦拭1號（博坤生物公司），按照干濕標(biāo)準(zhǔn)兩步法對載玻片上指紋樣本進行擦拭后放入1.5 mL離心管中。按試劑說明書使用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒對其進行消化。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)（低通量版）進行自動化DNA提取。

案件接觸性檢材檢驗實驗。棉簽擦拭物檢材直接剪取棉頭表層并置于離心提籃內(nèi)；脫落細胞粘取器粘取物直接取整個膜片放入1.5 mL離心管管底。除KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)選用高通量版外，其余同“單枚指紋DNA提取實驗”操作。

1.2.2 擴增及電泳分析

提取DNA的溶液采用ID Plus擴增試劑盒經(jīng)ProFlex? PCR系統(tǒng)，以10 μ L體系（模板均為1μ L）擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)3500xL遺傳分析儀進行檢測，GeneMarker軟件進行STR分型（RFU＞50）。未檢出或檢出10個基因座以下視為非有效檢出，檢出10個及以上基因座則作有效檢出。

2 結(jié)果

2.1 不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA回收實驗

將各樣本STR分型圖譜與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA分型進行比對，結(jié)果顯示所有樣本均得到準(zhǔn)確分型（表1），但0.1 ng標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本有一個在D7S820基因座缺失一個位點，另一個其RFU峰值偏低，只有51。其他0.15、0.2、0.25 ng標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本均檢出完整STR分型。

表1 不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA回收樣本檢測結(jié)果Table 1 Standard DNA recoveries from different initial quantities of DNA

2.2 單枚指紋樣本檢測結(jié)果

將樣本檢出分型與被取樣者的分型比對（表2），其中11個樣本檢出10個以上基因座的單一分型，且與被取樣者分型一致；雖有1個混合分型，但以被取樣者的分型為主要峰型。非有效DNA檢出率為42.8%；有效DNA檢出率為57.2%。

表 2 單枚指紋樣本檢測結(jié)果Table 2 Amount of exposed STR loci of the DNA extracted from single fingerprints

2.3 實際案件檢材檢測結(jié)果

870例實驗檢材檢驗結(jié)果見表3。

表 3 870例案件送檢脫落細胞類檢材檢測結(jié)果Table 3 Statistics of detected STR loci of exfoliated cells from 870 contact samples collected in daily forensic casework

其中206個樣本檢出單一16基因座分型，22個樣本檢出單一13～15基因座分型，51個樣本檢出單一10～13基因座分型，343個樣本檢出混合16基因座分型；70個樣本檢出10基因座以下分型，178個樣本未檢出分型。未檢出或10基因座以下分型視為非有效DNA提取，占比為28.5%；故有效DNA檢出率為71.5%。

3 討論

據(jù)文獻報道，接觸性檢材DNA含量普遍在0.1～1.5 ng之間[9]。對這類微量疑難檢材DNA的提取，需對從提取試劑到所用儀器的各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化[10]。本研究選用KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)結(jié)合博坤超微量磁珠法DNA提取試劑盒進行試驗，得到了較高的檢出率，原因可能如下：該試劑盒磁珠顆粒小，使其吸附DNA的面積更大，故可在磁珠表面富集更多的DNA，而其磁珠的超順磁性又保證了更好的懸浮性和分散性；加之所選用自動化工作站采用磁棒插入磁套浸進液體進行吸附，磁套離開磁棒后置于溶液進行釋放，相比通過磁力架反應(yīng)的傳統(tǒng)磁珠法可以提高檢出率。另外，該系列儀器可根據(jù)檢材條件而改變洗脫體積，故更有利于從微量脫落細胞樣本中獲得更高濃度的模板DNA。

本研究首先對選用的自動化提取系統(tǒng)進行提取靈敏度的測試。選擇濃度可準(zhǔn)確量化的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本，結(jié)果顯示該自動化系統(tǒng)可對含量低至0.1 ng的標(biāo)準(zhǔn)DNA成功回收，獲得的STR分型也相對完整，表明該自動化系統(tǒng)具有較高的提取靈敏度。

指紋是案件現(xiàn)場典型的接觸性檢材，而其中脫落細胞含量卻普遍較少，故屬疑難類接觸性檢材。利用本文所建方法對實驗室制備的單指紋樣本進行提取，STR分析顯示有效DNA檢出率可達到57.2%，為目前指紋DNA檢驗的較好結(jié)果。而且，由于整個提取過程全部自動化處理，方法的重復(fù)性高，能為穩(wěn)定可靠的大批量處理接觸性檢材DNA提供保障。在實際樣本的驗證實驗中，所選取的均為實際案件現(xiàn)場經(jīng)采樣工具二次轉(zhuǎn)移的接觸性檢材。經(jīng)STR檢驗分析，有效DNA檢出率達到71.5%，其中單一16基因座分型檢出率為23.7%。這一結(jié)果即便與手工精細操作相比也令人滿意，表明自動化系統(tǒng)應(yīng)用于接觸性檢材批量提取純化是切實可行的。

KingFisher磁珠純化儀可應(yīng)用于日常案件檢驗，其中高通量版可以同時處理96個樣本。磁珠顆粒小，富集效率高，洗脫體積靈活，均有利于從微量接觸檢材中獲得高濃度的模板DNA；又因其適用檢材類型廣，能有效提高各類檢材DNA的檢出率，因而可降低檢驗成本。磁珠法整合自動化工作站能有效控制人為因素對實驗的影響，減少DNA損失，同時還可避免樣本間的交叉污染，結(jié)果的準(zhǔn)確性更有保障，實驗時間更短，提取96個樣本僅需1 h 3 min。

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