黃丹化瘀飲對大鼠腦缺血再灌注損傷及腦組織BDNF、VEGF表達的影響

魯利甫，邱雪銀

（1.河南省濮陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，濮陽 457000；2.河南省濮陽市人民醫(yī)院腫瘤科，濮陽 457000）

缺血性腦血管疾病是因腦血管病變致使血流減少或中斷，使血管供應區(qū)出現缺血缺氧情況，出現一些病理生理反應。缺血后最重要的代償機制就是促進損傷區(qū)的血管再生，搭建良好的側支循環(huán)。有研究證實[1-2]，血管內皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）在重建缺血性腦血管病變的微循環(huán)中作用重大，是腦缺血后使血管再生的調控中心。腦源性神經生長因子（BDNF）在神經生長因子的家族中代表性最強，當神經元發(fā)生病變或損傷時，在神經元及其膠質細胞中會有BDNF大量表達，發(fā)揮支持、營養(yǎng)、再生等功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，均為健康雄性，SPF級，體質量平均（224±16）g，動物合格證號為 SYXK（蘇）2013-0018，由南京正大天晴公司提供。

1.1.2 藥液 黃丹化瘀飲組方主要包括：黃芪、丹參、葛根、鉤藤各30 g，川芎10 g，三七粉4.5 g。將中藥飲片浸泡30 min（蒸餾水），用文火煎煮15 min，煎煮3次后，煎煮藥液混合并過濾，過濾后的藥液分別濃縮為濃度為100%、200%、400%的黃丹化瘀飲（生藥含量分別 1、2、4 g/mL），儲于冰箱（4℃）中備用。

1.1.3 試劑與儀器 兔抗鼠VEGF一抗、BDNF一抗、VEGFR-1抗體、鼠抗兔二抗試劑盒均由武漢博士德公司提供；蛋白定量試劑盒（BCA）；ECL顯影液。自動脫水機，德國ASP200S；石蠟包埋機，德國EG1150H；冰箱，日本SANYO；圖文分析系統(tǒng)，德國。

1.2 方法

1.2.1 分組 實驗動物隨機分為5組（每組12只）：假手術組、腦缺血再灌注模型組（模型組）、小劑量組[7.20 g/（kg·d）]、中劑量組[14.40 g/（kg·d）]、大劑量組[28.80 g/（kg·d）]。劑量根據大鼠與人體的劑量折算[3]。假手術組、模型組用等體積蒸餾水代替。各組均術前7 d開始給藥（灌胃），每日1次，最后一次給藥1 h后，制備腦缺血模型（大腦中動脈）。

1.2.2 大鼠模型制備 制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，用Liu F[4]改良線栓法。具體方法：大鼠仰臥位固定，麻醉大鼠（用10%水合氯醛，劑量350 mg/kg），經頸部正中切口將頸動脈三角暴露，分離左側頸總動脈、頸內及頸外動脈，將頸總動脈及頸外動脈結扎，在頸外動脈接近分叉的地方剪“V”形切口，用鈍性魚線線栓（賴氨酸包被、直徑0.26 mm）斜行插入，由頸內動脈推進入大腦中動脈，遇到有阻力時止（約插入18～20 mm）。然后肌肉、皮膚縫合，術中大鼠肛溫（37.0±0.5）℃。假手術組不插線栓，其他組均此操作。

1.2.3 神經功能評分檢測 根據神經功能缺損評分（ZeaLonga評分法）[4]（5分制）進行大鼠神經功能評分：無神經功能損傷的癥狀，為0分；對側前爪無法完全伸展，為1分；向右側轉圈，為2分；向右側傾倒，為3分；意識喪失、不能自發(fā)行走，為4分。評分為1～3分的大鼠入組實驗。

1.2.4 腦梗死體積測定 大鼠腦缺血2 h后再灌注24 h，麻醉迅速取腦，速凍（-20℃）18 min后，將腦組織置入腦槽，隨腦組織冠狀面切成5片，并放入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC)2%的溶液中，避光置入水浴箱中（37℃）30 min。然后腦片放入多聚甲醛溶液（4%）中固定4～6 h，用數碼相機拍照，圖像分析系統(tǒng)計算梗死面積。

1.2.5 組織學檢查 在大鼠腦缺血2 h后進行再灌注，24 h后，水合氯醛（10%）麻醉，并迅速開胸，心臟用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛灌注并固定，然后斷頭取腦，并置入同樣灌注液，在4℃的條件下固定1周，脫水透明浸蠟、包埋，HE染色、封片，并觀察（在光鏡下）。

1.2.6 免疫組織化法 取大鼠腦組織切片，根據試劑盒說明書嚴格操作，雙氧水（H2O2）（3%）室溫孵育，兔抗鼠VEGF、BDNF、VEGFR-1一抗工作濃度均為1∶200，然后加二抗，蒸餾水沖洗，復染（蘇木素）、分化（鹽酸乙醇）、脫水（乙醇）、透明（二甲苯）、封片（中性樹膠），顯微鏡下觀察。

1.2.7 蛋白質印跡法（Western blot）檢測 取缺血側的大腦皮質，提取蛋白，BCA法對蛋白濃度進行測定。蛋白變性后，電泳（SDS-PAGE）、轉膜并封閉，然后分別加入一抗（VEGF、BDNF、VEGFR-1均為1∶1 000；β-actin 為 1∶2 000），在 4 ℃下孵育過夜。羊抗兔二抗（1∶2 000，HRP 標記），室溫孵育，增強化學發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像、顯影。Western blot條帶灰度值用Image J圖像分析系統(tǒng)，結果為VEGF、BDNF、VEGFR-1和β-actin的灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用重復測量的單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能評分及梗死體積分析 模型組腦缺血再灌注24 h后腦梗死體積及神經功能評分與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中劑量組、大劑量組腦梗死體積及神經功能評分與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；小劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1，圖1。

表1 各組神經功能評分及梗死體積分析（x±s）

2.2 各組腦缺血組織VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達分析 模型組VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達明顯高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中劑量組、大劑量組VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；小劑量組與模型組比較，VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2，圖2，圖 3，圖 4。

表2 各組腦缺血組織VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達分析（x±s）

3 討論

圖1 各組腦梗死再灌注24 h后TTC染色情況，深色為正常腦組織，淺色為梗死組織

圖2 各組腦缺血組織VEGF蛋白表達（immunohistoche-mistry，×400）

圖3 各組腦缺血組織BDNF蛋白表達（immunohistoche-mistry，×400）

圖4 各組腦缺血組織VEGFR-1蛋白表達（immunohistoche-mistry，×400）

黃丹化瘀飲為本院多年總結出的治療缺血性腦血管病的中藥方劑，其由黃芪、丹參、鉤藤、三七、川芎、葛根等草藥組成，主要通過活血、益氣、化瘀等發(fā)揮腦缺血損傷的治療作用[5]。趙志敏等[6]現代藥理證實，三七中的三七總皂苷能明顯使缺血再灌注大鼠腦組織BDNF蛋白合成明顯增加，上調BDNF mRNA的含量。丹參中的丹參酮ⅡA能明顯降低局部腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，也有研究證明其能夠上調人CREB調節(jié)轉錄輔激活因子1（TORC1-CREB）信號通路，增強相關基因轉錄，上調某些神經營養(yǎng)因子的表達，調節(jié)神經元損傷后再生等[7-8]。本研究結果顯示，黃丹化瘀飲中劑量、大劑量組大鼠神經功能評分、腦梗死面積均明顯低于模型組，由此提示此湯劑的有效性。

本研究結果顯示，模型組大鼠缺血再灌注損傷后，VEGF蛋白表達明顯高于假手術組，這是機體對抗腦組織損傷自身保護的一種方式，與模型組比較，中劑量組及大劑量干預后，能明顯上調BDNF、VEGF表達，從而發(fā)揮保護神經細胞的作用[9-10]。本研究結果還顯示，中劑量組及大劑量干預后，使VEGFR-1表達也明顯升高，這說明中、大劑量黃丹化瘀飲促進VEGF蛋白表達的同時，也能夠上調其受體表達來促進缺血區(qū)的血管生成。此結果和劉秀萍[11]的研究不同，分析其原因，可能是因為研究缺血再灌注時間不同所致（本研究選取時間點為缺血2 h/再灌注24 h，劉秀萍[11]的研究選取時間點為缺血2 h/再灌注12 h，藥物促進VEGFR-1表達作用可能還沒有充分顯現出來）。

黃丹化瘀飲用于腦缺血再灌注后腦損傷模型大鼠，能通過上調VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白水平發(fā)揮神經保護作用。不足的是，本研究是多種中藥方劑，對具體藥物的具體成分發(fā)揮的上調VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白水平的作用仍需進一步研究。

參考文獻：

[1] 何 佳，丁鳳菲，劉敏珍，等.VEGF/VEGFR在腦缺血再灌注損傷中的神經保護作用[J].神經損傷與功能，2013,3(8)：177-180.

[2] Mǎrgǎritescu O,Pirici D,Mǎrgǎritescu C.VEGF expression in human br-ain tissue after acute ischemic stroke[J].Rom J Morphol Embryol,2011,52(4):1283-1292.

[3] Oshikawa J,Urao N,Kim HW,et al.Extracellular SOD-derived H2O2promotes VEGF signaling in caveolae/lipid rafts and post-ischemic angiogenesis in mice[J].Plos one，2010,5(4):e10189.

[4] Yang J,Yao Y,Chen T,et al.VEGF ameliorates cognitive impairment in vivo and in vitro ischemia via improving neuronal viability and function[J].Neuromolecular Med,2014,16(2):376-388.

[5] 周賽男，藺曉源，易 健，等.補陽還五湯對腦缺血大鼠神經功能及細胞形態(tài)的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013,19(2)：251-254.

[6] 趙志敏，肖志娟，薛 茜，等.康腦液對腦缺血再灌注動物血管新生的影響[J]中國臨床藥理學，2014,30(10)：429-431.

[7] 承韶暉，陳曉蓉，侯冠峰，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉對腦缺血/再灌注模型大鼠腦梗死及神經功能評分影響的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合急救雜志，2012,19(5)：287-289.

[8] 金錫嬌，歐陽潔，郭 瑩，等.葛根黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織NO及NOS的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2013,22(8)：1360-1361.

[9] 王任燁，俞雪鋒，謝昫珮，等.氟西汀對恐懼記憶形成階段 BDNF、Bcl-2表達的影響[J].藥學學報，2014,19(4)：463-469.

[10]馬建鵬.康腦液對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經血管因子、MMP-9、ERK1/2表達的影響[D].石家莊：河北北方學院，2015.

[11]劉秀萍，鄧 方.銀杏內酯和白果內脂對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF的表達的影響[J].中風與神經疾病雜志，2015,32(2)：108-110.