汞脅迫對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲抗氧化酶活性的影響1)

耿飛飛 于洪賢 劉曼紅 孟瑤

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

搖蚊幼蟲為完全變態(tài)類昆蟲，是一種分布廣泛且種類數(shù)量眾多的底棲動(dòng)物，具有解毒能力低、對(duì)污染物的暴露敏感、生活周期短等特性，且在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)易飼養(yǎng)，是水體質(zhì)量監(jiān)測(cè)中的重要指示生物。在加強(qiáng)水生態(tài)毒理學(xué)應(yīng)用研究中，搖蚊幼蟲被廣泛應(yīng)用于毒性測(cè)試[1-2]。依據(jù)搖蚊幼蟲對(duì)水體中重金屬的敏感性，開展了重金屬對(duì)搖蚊幼蟲的急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)[3]。相關(guān)研究有，Cu2+、Cd2+對(duì)紅裸須搖蚊(Propsilocerusakamusi)幼蟲和羽搖蚊(Chironomusplumosus)幼蟲的急性毒性效應(yīng)及對(duì)過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響[4-5]等。Hg2+是存在于水環(huán)境中極具毒性的重金屬，其毒性涉及到氧化應(yīng)激，即Hg2+可誘導(dǎo)自由基的形成，并改變了細(xì)胞的抗氧化能力[6-8]，暴露于含有Cd和Cu的沉積物，對(duì)伸展搖蚊(Chironomustentans)幼蟲具有致畸作用[9]。

關(guān)于生物體內(nèi)重要解毒酶，我國(guó)近年來也開展了一些工作，研究的污染物涉及重金屬、有機(jī)物污染物和工業(yè)廢水?；谶@些特性，搖蚊幼蟲作為水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其體內(nèi)抗氧化酶的活性或表達(dá)量與重金屬Hg濃度之間的效應(yīng)關(guān)系，可作為監(jiān)測(cè)環(huán)境污染的一項(xiàng)靈敏指標(biāo)。抗氧化酶系被用作指示環(huán)境污染的早期預(yù)警，從而成為分子毒理學(xué)生物標(biāo)志物研究的熱點(diǎn)之一[10-12]。然而，搖蚊幼蟲在Hg2+的脅迫下，生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，如CAT、過氧化物酶(POD)、SOD、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GST)的活性如何，還需要進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證。

紅裸須搖蚊是搖蚊中的優(yōu)勢(shì)種，廣泛分布于我國(guó)的淡水環(huán)境中，在水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中占有重要的地位。本研究以紅裸須搖蚊幼蟲為實(shí)驗(yàn)材料，研究4種生物指標(biāo)(CAT、POD、SOD、GST)在汞暴露下的變化規(guī)律，目的是探究汞對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲抗氧化系統(tǒng)的效應(yīng)，同時(shí)用以評(píng)估紅裸須搖蚊幼蟲對(duì)汞脅迫的敏感性，為將紅裸須搖蚊幼蟲重金屬污染的生物監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)用紅裸須搖蚊購(gòu)于哈爾濱市哈平路花鳥魚蟲市場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)室蒸餾水環(huán)境下，饑餓處理24h，挑選活性好、大小一致的4齡幼蟲用于試驗(yàn)。試驗(yàn)用水為蒸餾水，每日投喂顆粒金魚料作為搖蚊幼蟲食物，水溫(21.0±0.5)℃、pH為7.0±0.5，室內(nèi)自然光下進(jìn)行。試驗(yàn)用的Hg2+用分析純HgCl2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，姜堰市環(huán)球試劑廠)配置；用蒸餾水將HgCl2配成一定質(zhì)量濃度的母液，再以蒸餾水稀釋成所需質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)溶液。蛋白質(zhì)、CAT、POD、SOD的測(cè)定，利用相應(yīng)的試劑盒(南京建成生物工程研究所)完成。采用SPSS17.0軟件計(jì)算半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度(ch)及95%置信區(qū)間。

利用凈水染毒法試驗(yàn)。通過預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)寇氏改良法得到紅裸須搖蚊幼蟲的48 h半致死質(zhì)量濃度(cs)為3.61 mg/L。將HgCl2用蒸餾水設(shè)置成質(zhì)量濃度為0(對(duì)照組)、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg/L的處理組，每組設(shè)置3個(gè)平行樣。將用于試驗(yàn)的紅裸須搖蚊幼蟲放入500 mL帶有Hg2+的燒杯中，每個(gè)燒杯放50個(gè)，6、24、48、72 h取活性較好的搖蚊幼蟲置于冰箱中-20 ℃保存，用作蛋白質(zhì)、CAT、POD、SOD的測(cè)定。

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在同一時(shí)間段、不同質(zhì)量濃度Hg2+對(duì)酶活性的影響，用SPSS軟件的單因素方差分析進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hg2+對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲CAT活性的影響

用不同質(zhì)量濃度的HgCl2(0、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg/L)，分別處理紅裸須搖蚊4齡幼蟲6、24、48、72 h。6 h其體內(nèi)CAT活性，在不同處理組表現(xiàn)為：隨著汞質(zhì)量濃度的增大，對(duì)酶的活性影響是先增加后減少的變化趨勢(shì)，在5.4 mg/L時(shí)被顯著誘導(dǎo)，達(dá)到最大值(0.233±0.002)U/mg；在8.1 mg/L時(shí)開始下降，為(0.039±0.025)U/mg。除了質(zhì)量濃度8.1 mg/L，其它的質(zhì)量濃度隨著毒物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在24 h被顯著誘導(dǎo)，表現(xiàn)出最大的酶活性，然后在48 h以后酶的活性被抑制，即出現(xiàn)不同程度的下降。處理組8.1 mg/L在作用時(shí)間48 h，CAT活性最大，為(0.271±0.016)U/mg，在Hg2+作用72 h每個(gè)處理組的CAT活性被抑制，都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(見表1)。同一時(shí)間不同質(zhì)量濃度的Hg2+處理，對(duì)CAT活性影響的LSD法多重比較檢驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h與72 h的各質(zhì)量濃度Hg2+對(duì)CAT活性都沒有明顯差異，僅在24 h時(shí)SOD活性在對(duì)照組與其他質(zhì)量濃度處理組之間的差異達(dá)到了顯著性水平(p<0.05)(見表1)。

表1 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的CAT活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 Hg2+對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲POD活性的影響

在Hg2+脅迫下，不同處理組的紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)POD的活性，在24 h時(shí)被誘導(dǎo)，在(0.615±0.020)～(0.683±0.028)U/mg之間，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)有增加的趨勢(shì)。同一時(shí)間不同處理組，對(duì)POD活性影響的LSD法多重比較檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各時(shí)間段，各質(zhì)量濃度Hg2+的POD活性與對(duì)照組相比變化不顯著(p>0.05)。說明POD在受到Hg2+脅迫時(shí)，不同處理時(shí)間和不同處理組的紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)POD活性，沒有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)相對(duì)復(fù)雜的變化(見表2)。

表2 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的POD活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 Hg2+對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)SOD活性的影響

由表3可見：Hg2+脅迫下，不同的處理組紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)SOD酶的活性，高質(zhì)量濃度的處理組(5.4、8.1 mg/L)，在長(zhǎng)的暴露時(shí)間(48、72 h)，SOD的活性都較高，在72 h都達(dá)到最大值，并且5.4 mg/L處理組最大，為(0.922±0.055)U/mg。不同處理組，如1.6、2.4、3.6 mg/L處理組，在48 h的SOD酶活力較低些，為(0.333±0.062)～(0.814±0.065)U/mg；5.4 mg/L處理組，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在24 h時(shí)SOD酶活力降低，為(0.420±0.086)U/mg；8.1 mg/L處理組，在暴露6、24 h，紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)SOD酶活力均稍低于對(duì)照組。同一時(shí)間不同質(zhì)量濃度的Hg2+處理，對(duì)SOD活性影響的LSD法多重比較檢驗(yàn)結(jié)果顯示，24、48 h的各質(zhì)量濃度Hg2+對(duì)SOD活性都沒有明顯差異，僅在72 h時(shí)SOD活性在對(duì)照組與其他質(zhì)量濃度處理組之間的差異達(dá)到了顯著性水平(p<0.05)(見表3)。

表3 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的SOD活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 Hg2+對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)GST活性的影響

由表4可見：Hg2+脅迫下，不同的處理組紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)GST酶的活性，在暴露24 h，1.6、2.4、3.6、5.4 mg/L各處理組，GST的活性都表現(xiàn)為較高，并且短的暴露時(shí)間24 h達(dá)到最大值為(0.767±0.082)U/mg。而在高質(zhì)量濃度(8.1 mg/L)處理組，暴露6 h表現(xiàn)最高，為(0.808±0.060)U/mg。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在24、48、72 h時(shí)，GST酶活力逐漸降低，而暴露6 h各處理組酶活性差異顯著。同一時(shí)間不同質(zhì)量濃度的Hg2+處理，對(duì)GST活性影響的LSD法多重比較檢驗(yàn)結(jié)果顯示，暴露48、72 h的各質(zhì)量濃度Hg2+對(duì)GST活性都沒有明顯差異(p>0.05)；在6、24 h時(shí)，GST活性在對(duì)照組與其他質(zhì)量濃度處理組之間的差異達(dá)到了顯著性水平(p<0.05)。說明在受到Hg2+脅迫時(shí)，不同處理組的紅裸須搖蚊幼蟲體內(nèi)GST活性發(fā)生明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表4 Hg2+處理后紅裸須搖蚊幼蟲的GST活性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 討論

關(guān)于汞對(duì)水生動(dòng)物的急性毒性研究已有一些報(bào)道。在對(duì)魚類和甲殼類動(dòng)物的研究中，孔祥會(huì)等[13]將金魚幼魚置于質(zhì)量濃度為0、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/L的Hg2+溶液中，分別在汞暴露1、7、15 d時(shí)取樣，測(cè)定不同質(zhì)量濃度Hg2+暴露下SOD、CAT活性及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果顯示，SOD、CAT均表現(xiàn)出在較長(zhǎng)的暴露時(shí)間及較高質(zhì)量濃度Hg2+脅迫下的誘導(dǎo)效應(yīng)，MDA含量也因Hg2+暴露而明顯積累。

CAT、POD、SOD、GST等會(huì)受到外界刺激的影響，因而對(duì)生物機(jī)體抗氧化狀態(tài)的測(cè)定、對(duì)于理解毒性效應(yīng)機(jī)制及預(yù)測(cè)生物體內(nèi)的潛在性損傷是十分重要的[7]。重金屬對(duì)搖蚊幼蟲的抗氧化酶的研究中發(fā)現(xiàn)，不同的搖蚊幼蟲對(duì)污染物的耐受性存在一定的差異，Cd2+對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲與其它搖蚊幼蟲明顯不同，該物種對(duì)Cd2+的急性毒性不敏感，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的耐受能力[1]。本研究結(jié)果顯示，CAT和SOD均表現(xiàn)出較長(zhǎng)的暴露時(shí)間及較高質(zhì)量濃度Hg2+脅迫下的誘導(dǎo)效應(yīng)，紅裸須搖蚊幼蟲為了減弱汞脅迫帶來的損害，CAT和SOD均有增加然后減少的拋物線形式的變化。CAT等抗氧化防御系統(tǒng)的一個(gè)重要特征，是其活性成分或含量可由于污染物的脅迫而發(fā)生改變，從而可間接反映環(huán)境中氧化污染的存在，因此可作為環(huán)境污染脅迫的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅裸須搖蚊幼蟲體組織抗氧化防御系統(tǒng)中，主要抗氧化酶CAT和SOD活性對(duì)Hg2+具有較高的敏感性，而隨著重金屬離子暴露質(zhì)量濃度的升高，其含量和活性均呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可以作為生物標(biāo)志物檢測(cè)水體中Hg2+的早期污染。而且GST活性對(duì)Hg2+有誘導(dǎo)效應(yīng)，具有極高的檢測(cè)靈敏度，但是，由于檢測(cè)必須在純凈的溶液中進(jìn)行，因此作為實(shí)際檢測(cè)物質(zhì)還具有一定難度[14]。在Hg2+暴露下的紅裸須搖蚊幼蟲體組織，POD活性表現(xiàn)的規(guī)律性不明顯，呈相對(duì)復(fù)雜的變化，因此認(rèn)為POD不能有效用來檢測(cè)水體的早期Hg2+污染。Park et al.[15]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)毒物暴露后，搖蚊幼蟲體內(nèi)GSTs的活性發(fā)生了顯著的變化。為進(jìn)一步完善Hg2+對(duì)紅裸須搖蚊的抗氧化酶系統(tǒng)的研究，如乙酰膽堿酯酶(AChE)、GSTs等酶活性如何，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 鄭先云，龍文敏，郭亞平，等.Cd2+對(duì)紅裸須搖蚊(Propsilocerusakamusi)的急性毒性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，21(1)：86-91.

[2] 葛士林，曹傳旺，王志英.3種農(nóng)藥對(duì)紅裸須搖蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和AChE活性的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(1)：108-109，126.

[3] VERMEULEN A C， LIBERLOO G， DUMONT P， et al. Exposure ofChironomusripariuslarvae (diptera) to lead， mercury andβ-sitosterol： effects on mouthpart deformation and moulting[J]. Chemosphere，2000，41(10)：1581-1591.

[4] 李浩，王琴，鄧金釵，等.Cu2+對(duì)羽搖蚊幼蟲(Chironomusplumosus)口器致畸作用和抗氧化酶活性的影響[J].生態(tài)和農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2012，28(2)：203-208.

[5] 李浩.銅和鎘對(duì)羽搖蚊幼蟲(Chironomusplumosus)和紅裸須搖蚊幼蟲(Propsilocerusakamusi)的毒性效應(yīng)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[6] LUND B O， MILLER D M， WOODS J S. Studies on Hg(II)-induced H2O2formation and oxidative stress in vivo and in vitro in rat kidney mitochondria[J]. Biochemical Pharmacology，1993，45(10)：2017-2024.

[7] HUSSAIN S， RODGERS D A， DUHART H M， et al. Mercuric chloride-induced reactive oxygen species and its effect on antioxidant enzymes in different regions of rat brain[J]. Journal of Environmental Science and Health Part B： Pesticides， Food Contaminants， and Agricultural Wastes，1997，32(3)：395-409.

[8] KOBAL A B， PREZELJ M， HORVAT M， et al. Glutathione level after long-term occupational elemental mercury exposure[J]. Environmental Research，2008，107(1)：115-123.

[9] MARTINEZ E A， MOORE B C， SCHAUMLOFFEL J， et al. Morphological abnormalities inChironomustentansexposed to cadmium： and copper-spiked sediments[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2003，55(2)：204-212.

[10] PASCUAL P， PEDRAJAS J R， TORIBIO F， et al. Effect of food deprivation on oxidative stress biomarkers in fish (Sparusaurata)[J]. Chemico-Biological Interactions，2003，145(2)：191-199.

[11] ORUC E O， SEVGILER Y， UNER N. Tissue-specific Oxidative stress responses in fish exposed to 2,4-D and azinphosmethyl[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C： Toxicology & Pharmacology，2004，137(1)：43-51.

[12] ZHANG J F， SHEN H， WANG X R， et al. Effects of chronic exposure of 2,4-dichlorophenol on the antioxidant system in liver of freshwater fishCarassiusauratus[J]. Chemosphere，2004，55(2)：167-174.

[13] 孔祥會(huì)，王書平，仝顏娜，等.汞暴露對(duì)金魚幼魚抗氧化防護(hù)的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(4)：187-191.

[14] 呂彩云.重金屬檢測(cè)方法研究綜述[J].資源開發(fā)與市場(chǎng)，2008，24(10)：887-890，898.

[15] PARK K， BANG H W， PARK J， et al. Ecotoxicological multilevel-evaluation of the effects of fenbendazole exposure toChironomusripariuslarvae[J]. Chemosphere，2009，77(3)：359-367.