小鼠miR-125a超表達(dá)載體的構(gòu)建

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精子發(fā)生是指精子在睪丸內(nèi)產(chǎn)生的全過程，包括精細(xì)管上皮的生精細(xì)胞由精原細(xì)胞經(jīng)過精母細(xì)胞到精子細(xì)胞的増殖分化過程和精子形成過程。哺乳動物中，雄性生殖細(xì)胞發(fā)育成為精子的過程受到外因和內(nèi)因的調(diào)控[1]。據(jù)估計大約有1 000個基因參與人精子發(fā)生的過程，其中僅有351個在生殖細(xì)胞中表達(dá)，這些基因在轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯水平調(diào)控精子發(fā)生[2]。這些基因功能的發(fā)揮需要大量的microRNAs對其在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上進(jìn)行調(diào)控。

microRNAs (miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸、在進(jìn)化上高度保守的非編碼單鏈RNA分子。在人類基因組中有2%～3%的基因編碼miRNAs[3]。目前已經(jīng)有大量報道m(xù)iRNAs的表達(dá)具有組織特異性，并且已經(jīng)證明miRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化過程中起重要作用[4-6]。同時，越來越多的研究表明miRNAs對于調(diào)節(jié)精子發(fā)生及維持雄性生育是必需的；如缺乏形成miRNAs必需的Dicer酶小鼠，產(chǎn)生異常伸長的精子，并且呈現(xiàn)雄性不育[7]；生殖干細(xì)胞的分裂及干細(xì)胞通過G1/S關(guān)卡需要miRNAs的參與[8]。Mmu-miR-125a35p(后文統(tǒng)稱為miR-125a)位于小鼠基因組第17號染色體上，與mmu-miR-99b和mmu-let-7e成簇分布。研究發(fā)現(xiàn)通過抑制miR-125a的表達(dá)能夠促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[9]，然而關(guān)于miR-125a在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞中的研究還未見報道。

為了探明miR-125a在精子發(fā)生中的功能，本研究構(gòu)建了miR-125a的超表達(dá)載體，并初步驗(yàn)證其超表達(dá)效果，為進(jìn)一步研究miR-125a的功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與主要試劑

7日齡和7周齡公豬采購于陜西楊凌某豬場；GC-1spg細(xì)胞系由上海交通大學(xué)何祖平教授惠贈，由本試驗(yàn)室傳代凍存；大腸桿菌DH5α及質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)為本試驗(yàn)室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶購于Gibico公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、熒光定量檢測試劑盒(DRR820S)、Taq DNA聚合酶、DNA限制性內(nèi)切酶(HindⅢ、BamHⅠ)和T4 DNA連接酶購于大連寶生物工程有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于OMEGA公司； Trizol，Lipofectamine 2000 Reagent，opti-MEM購于Invitrogen公司；小鼠抗GAPDH和山羊抗C-KIT多克隆抗體購于Santa Cruz公司；蛋白裂解液RIPA、PMSF、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠和HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Thermo公司；引物合成于上海生工公司。

1.2 MiR-125a、Gapdh、C-kit和Pcna的定量檢測

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照基因庫提供的鼠Gapdh(NM_008085.1)、C-kit(NM_001122733.1)和Pcna(NM_011045.2)的完整序列設(shè)計引物，引物跨外顯子設(shè)計；根據(jù)Chen文獻(xiàn)[10]設(shè)計miR-125a的反轉(zhuǎn)錄和PCR引物，引物序列和擴(kuò)增長度如表1。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時定量 RNA提?。篢rizol試劑常規(guī)法抽提組織和細(xì)胞總RNA，DEPC水溶解沉淀，核酸蛋白分析儀(ND-1000 Spectrometer, USA)測定RNA濃度和純度，根據(jù)RNA在A260 nm/A280 nm≥1.8及凝膠電泳28S/18SRNA條帶比值≥1.5鑒定RNA純度及完整性。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

miR-125a和內(nèi)參基因的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：RNA 1 μg、5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL，DEPC水補(bǔ)足10 μL至一無RNase的PCR管中；42 ℃孵育3 min，4 ℃暫時保存。隨后加入5×Prime Script? Buffer 4 μL、Prime Script? RT Enzyme Mix I 1 μL、miR-125a RT引物1 μL(或者RT Primer Mix 4 μL)，DEPC水補(bǔ)足20 μL；16 ℃孵育30 min，42 ℃(或者37 ℃)孵育30 min，85 ℃孵育1 min，4 ℃保存。

定量PCR反應(yīng)：利用SYBR Green 熒光染料法于定量PCR儀(IQ5，BioRad)檢測miR-125a、Gapdh、C-kit和Pcna的表達(dá)。反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL、Primers(F+R)2 μL、SYBR GreenI熒光染料10 μL、滅菌水7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)；72 ℃ 10 min，每個樣品均作三復(fù)管PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)在Excel中采用2-△△Ct法分析匯總。

1.3 MiR-125a超表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

1.3.1 MiR-125a 前體PCR引物設(shè)計與合成 在UCSC數(shù)據(jù)庫搜索得到小鼠miR-125a前體序列(pre-miR-125a)，并且向其兩端側(cè)翼各延伸150 bp得到一段約380 bp的序列，利用Premier 5設(shè)計含有酶切位點(diǎn)的引物，引物序列見表1。下劃線分別為Hind Ⅲ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。

1.3.2 MiR-125a 真核表達(dá)載體(pcDNA3.1(+)-miR-125a)的構(gòu)建 PCR反應(yīng)擴(kuò)增pre-miR-125a：以C57小鼠基因組DNA為模板，pre-miR-125a-F和pre-miR-125a-R分別為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系如下：模板DNA 1μL、Primers(F+R)2 μL、2×Taq mix 10 μL、滅菌水7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

膠回收、雙酶切、連接和鑒定：pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和純化得到的PCR片段分別進(jìn)過HindⅢ和BamHⅠ后，在T4 DNA連接酶作用下，16 ℃連接過夜；經(jīng)過轉(zhuǎn)化和涂板，挑取陽性菌落進(jìn)行搖菌。將菌液PCR鑒定正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取純化，分別用BamHⅠ單酶切，HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)酶切鑒定正確的克隆送北京Invitrogen公司測序進(jìn)一步證實(shí)。

1.3.3 MiR-125a超表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染 GC-1 spg細(xì)胞在含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h前接種5×105個細(xì)胞到6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右開始轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine 2000 Reagent說明書，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體及pcDNA3.1(+)-miR-125a重組質(zhì)粒，共分3組：未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1(+)空載體組、pcDNA3.1(+)-miR-125a重組質(zhì)粒組、每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)30 h，待細(xì)胞密度達(dá)到100%時收取細(xì)胞進(jìn)行下步試驗(yàn)。

1.4 目的基因的Western blot檢測

細(xì)胞的轉(zhuǎn)染按照上步轉(zhuǎn)染進(jìn)行操作，設(shè)置2個處理組：pcDNA3.1(+)空載體組、pcDNA3.1(+)-miR-125a重組質(zhì)粒組、每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解緩沖液裂解后收集上清蛋白；采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)經(jīng)過變性處理后取20 μg進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。蛋白電泳S1：80V，5min；S2: 120V，1.5 h。半干法15V 轉(zhuǎn)膜25 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗GAPDH和山羊抗C-KIT多克隆抗體4 ℃孵育過夜，然后分別以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠和兔抗山羊二抗與之在室溫反應(yīng)1 h；ECL法顯色，照相，分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiR-125a在7日齡小鼠和7周齡小鼠睪丸組織中的差異表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-125a在小鼠睪丸的發(fā)育過程中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，隨著睪丸的發(fā)育成熟呈現(xiàn)上升趨勢(圖1)。此結(jié)果暗示miR-125a在成年小鼠睪丸中的高表達(dá)可能與精子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞的增殖與分化有關(guān)。

2.2 MiR-125a前體片段(pre-miR-125a)的擴(kuò)增

為了進(jìn)一步探究miR-125a與小鼠雄性生殖細(xì)胞增殖與分化的聯(lián)系，采用PCR方法將pre-miR-125a從小鼠基因組DNA擴(kuò)增出來，雙酶切后定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建miRNA真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-miR-125a，進(jìn)而轉(zhuǎn)染至GC-1 spg細(xì)胞。PCR產(chǎn)物10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在290 bp處有一特異擴(kuò)增條帶，與理論條帶長度符合(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-125a的鑒定

隨機(jī)挑取單個陽性菌落進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與miR-125 a前體片段擴(kuò)增條件一致。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖3A。經(jīng)菌液PCR鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ單酶切，Hind Ⅲ/BamHⅠ雙酶切鑒定，分別可以得到5 728 bp，5 428 bp和290 bp的片段，其大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖3B)。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送往Invitrogen公司測序鑒定，測序結(jié)果顯示miR-125a前體片段沒有突變，說明質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-125a構(gòu)建成功。

圖1 miR-125a在小鼠睪丸組織中的差異表達(dá)Fig.1 Differential expression of miR-125a in testis tissue

圖2 miR-125a前體片段的PCR擴(kuò)增鑒定Fig.2 PCR verification of pre-miR-125a

2.4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-125a的細(xì)胞中miR-125a的差異表達(dá)

將pcDNA3.1(+)-miR-125a質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至小鼠GC-1 spg細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后，抽提細(xì)胞總RNA；實(shí)時定量PCR檢測空白對照組、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組和pcDNA3.1(+)-miR-125a處理組細(xì)胞總RNA中miR-125a的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖4),空質(zhì)粒組與空白對照相比，沒有明顯的差異，表明pcDNA3.1(+)質(zhì)粒對GC-1spg細(xì)胞沒有明顯的毒副作用；與空白組和空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-miR-125a質(zhì)粒的試驗(yàn)組中miR-125a表達(dá)水平升高約3.5倍，表明pcDNA3.1(+)-miR-125a能夠在GC-1 spg細(xì)胞中過表達(dá)miR-125a。

2.5 miR-125a對生殖細(xì)胞增殖分化的影響

如圖5所示，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-miR-125a質(zhì)粒與空質(zhì)粒組相比，與生殖細(xì)胞分化密切相關(guān)基因C-kit有顯著的上升(約4倍)，而與生殖細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因Pcna并無明顯的變化。初步表明miR-125a可能在一定程度上促進(jìn)生殖細(xì)胞的分化，但對增殖可能沒有明顯的促進(jìn)或者抑制作用。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在過表達(dá)了miR-125a后C-KIT有明顯的上升趨勢(約3倍)(圖6)。

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-125a的鑒定A. 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定；B. 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Verification of the recombinant plasmid(pcDNA3.1(+)-miR-125a)A. PCR detection for bacterial liquid； B. Restriction analysis

圖4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-125a在GC-1 spg細(xì)胞系中的過表達(dá)效果Fig.4 Differential expression of miR-125a in GC-1 spg cells

圖5 qRT-PCR檢測GC-1 spg細(xì)胞超表達(dá)miR-125a后C-kit和Pcna表達(dá)的變化Fig.5 Expression of C-kit and Pcna in GC-1 spg cells detected by qRT-PCR analysis

圖6 Western blot檢測C-KIT在GC-1 spg細(xì)胞超表達(dá)miR-125a后的表達(dá)變化Fig.6 Western blot analysis of C-KIT expression in GC-1 spg cells transfected with pcDNA3.1(+)-miR-125a

3 討 論

位于小鼠基因組17號染色體上的miR-125a與miR-99b和let-7e成簇分布，是Lagos-Quintana等在小鼠腦組織中克隆到的一個與線蟲miRNA-Lin-4具有高度同源性的miRNA[11]。

在胚胎干細(xì)胞中，miR-125a在未分化的細(xì)胞中表達(dá)量很低，但隨著分化的進(jìn)行，表達(dá)量逐漸升高[12]。另外，通過抑制miR-125a的表達(dá)能夠促進(jìn)體細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS)的重編程[13]。此外，miR-125a在果蠅發(fā)育過程中的表達(dá)具有時序性，僅在果蠅發(fā)育到蛹和成蟲階段表達(dá)而在胚胎和幼蟲發(fā)育階段不表達(dá)[14-16]。然而關(guān)于miR-125a在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞中的研究還未見報道。本研究首先分析了miR-125a在小鼠睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示其在7周齡成年小鼠睪丸中高表達(dá)，說明其可能參與生殖細(xì)胞的增殖與分化過程。結(jié)合文獻(xiàn)所報道的miR-125a表達(dá)具有時序性，并且在分化的胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)[12]，預(yù)測其與生殖細(xì)胞的分化具有密切的聯(lián)系。為了進(jìn)一步探究miR-125a與小鼠雄性生殖細(xì)胞分化的關(guān)系，通過pcDNA3.1(+)-miR-125a超表達(dá)質(zhì)粒載體在生殖細(xì)胞系GC-1 spg中進(jìn)行了驗(yàn)證。GC-1 spg細(xì)胞系是一種介于B型精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞之間的雄性生殖細(xì)胞。本試驗(yàn)中，將miR-125a的前體從小鼠基因組DNA擴(kuò)增出來，雙酶切后定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-miR-125a超表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后pcDNA3.1(+)-miR-125a在CMV啟動子作用下轉(zhuǎn)錄為具有"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)的pre-miR-125a，通過細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶 Ⅲ Dicer的作用剪接加工形成成熟的miR-125a，從而發(fā)揮超表達(dá)調(diào)控作用。試驗(yàn)觀察到轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-miR-125a的GC-1spg細(xì)胞中C-kit mRNA和蛋白的表達(dá)量上升，但與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因Pcna并沒有明顯的變化。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了miR-125a的超表達(dá)載體，并初步驗(yàn)證其超表達(dá)效果，這為進(jìn)一步研究miR-125a的功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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