靶向β-葡萄糖醛酸苷酶的抗腫瘤藥物研究進(jìn)展

郭家鼎，郝 佳*

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300193)

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase，簡(jiǎn)稱 βGU)是人體重要的酸性溶酶體水解酶，參與機(jī)體多種代謝過(guò)程。由于該酶的生物學(xué)特性及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的特異性表達(dá)，因而引起學(xué)者的長(zhǎng)期關(guān)注。本文綜述了 β-葡萄糖醛酸苷酶與腫瘤的關(guān)系及基于 β-葡萄糖醛酸苷酶的抗腫瘤藥物的研發(fā)近況。

1 βGU簡(jiǎn)介及其與腫瘤的關(guān)系

βGU是一種酸性溶酶體酶，是由 4個(gè)相同的77,KDa大小的糖蛋白組成的四聚體結(jié)構(gòu)。Glu540、Glu451及Tyr504 3個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基所在的區(qū)域組成了該酶的活性催化位點(diǎn)。其中 Glu540為親核中心，Glu451為給質(zhì)子中心，Tyr504雖作用不明，但在功能上卻不可或缺[1]。βGU 是含葡萄糖醛酸苷鍵結(jié)構(gòu)多糖類物質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，具有極高的催化效率，幾乎可以水解任何含 β-葡萄糖醛酸苷結(jié)構(gòu)的底物。βGU對(duì)pH值的敏感性，為其在抗腫瘤靶向治療中的應(yīng)用提供良好契機(jī)。

腫瘤組織中，βGU水平較正常細(xì)胞存在明顯的異常表達(dá)，且這種高表達(dá)現(xiàn)象在廣泛的惡性腫瘤中都有體現(xiàn)，如乳腺癌、肺癌、胃腸道、黑色素瘤等[2]。βGU活性最佳的pH值為4左右，與溶酶體內(nèi)的pH值相仿，而在正常體液環(huán)境(pH值7.2左右)中，則僅顯示 10%,的活性[3]。有別于正常細(xì)胞的 βGU 只存在于溶酶體中，βGU在腫瘤細(xì)胞中被炎癥細(xì)胞外排到細(xì)胞外的壞死區(qū)域，而實(shí)體腫瘤中缺氧及酸性的微環(huán)境更有利于提高 βGU的活性水平。因此，異?；钴S的βGU是靶向抗腫瘤研究中重要的研究靶標(biāo)。

2 基于βGU的PMT藥物

圖1 基于βGU的PMT藥物實(shí)例Fig.1 Examples of PMT Drugs based on Beta-GU

前體藥物單藥治療(PRODRUG MONOTHERAPY，簡(jiǎn)稱 PMT)是指單獨(dú)使用前體藥物，利用腫瘤微環(huán)境，將低毒前藥在腫瘤組織轉(zhuǎn)化為原藥的治療理念。由于 βGU在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中的高水平表達(dá)，基于βGU的PMT藥物一度成為研究熱點(diǎn)，很多具有細(xì)胞毒性的化療藥物都進(jìn)行了針對(duì) βGU的前藥衍生。一般情況下，由于前藥分子中的葡萄糖醛酸基團(tuán)增加了分子的親水性，使得細(xì)胞對(duì)藥物的被動(dòng)攝取受阻，進(jìn)而正常細(xì)胞中只存在于溶酶體中的 βGU無(wú)法將前藥轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的原藥分子，所以基于βGU的PMT藥物與原藥相比毒性都有顯著降低。與此同時(shí)，腫瘤組織的胞外就存在大量的 βGU，可以高效地將前藥分子轉(zhuǎn)化為原藥。較低的毒性加上腫瘤組織的靶向性激活使得基于 βGU的 PMT藥物具有良好的研究前景(見(jiàn)圖1)。

紫杉醇是治療婦科腫瘤和非小細(xì)胞肺癌臨床上常用的化療藥物，但在治療劑量下，紫杉醇存在諸如骨髓抑制和感覺(jué)神經(jīng)病變等一系列不良反應(yīng)。而由于其溶解性很差，需要助溶劑才能注射給藥，容易引起過(guò)敏反應(yīng)。研究人員設(shè)計(jì)并合成了紫杉醇 βGU前藥(圖1中的化合物1)，其細(xì)胞毒性降低了70倍，穩(wěn)定性良好，水溶性也相應(yīng)有所提高，且在 βGU 存在下迅速分解并釋放原藥[4]。環(huán)杷明的 βGU前藥(圖 1中的化合物 2)細(xì)胞毒性比環(huán)杷明顯著下降，體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)表明，在無(wú) βGU 條件下，化合物 2對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，而在大鼠移植膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型上，化合物2表現(xiàn)出比原藥環(huán)杷明還要優(yōu)良的抗腫瘤活性，用藥后腫瘤密度顯著降低[5，6]。白樺脂酸目前正作為治療黑色素瘤的化療藥物進(jìn)行臨床II試驗(yàn)，其βGU前藥(圖1中的化合物3)在體外試驗(yàn)中同樣表現(xiàn)出低毒、靶向釋藥的特點(diǎn)，具有被進(jìn)一步研究的潛力[7]。氨基喜樹(shù)堿的 9位 βGU前藥(圖 1中的化合物 4)被體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其單獨(dú)給藥對(duì)人腫瘤裸鼠移植瘤具有良好的抗腫瘤活性，當(dāng)其與抗血管生成藥單克隆抗體 DC101聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型的抗腫瘤活性顯著提高，優(yōu)于單獨(dú)給藥的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)化合物 4尤其適合針對(duì)巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤的治療[8]。微管蛋白聚合抑制劑MMAE已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)上市治療淋巴瘤，該藥物抗腫瘤活性強(qiáng)，可以達(dá)到納摩爾級(jí)別，且抗癌譜廣泛，但仍存在一些不良反應(yīng)和毒副作用。研究人員將其進(jìn)行 βGU前藥修飾，設(shè)計(jì)并合成了前藥分子化合物5(圖1中的化合物5)。體外實(shí)驗(yàn)表明，前藥 5相比原藥細(xì)胞毒性顯著降低，且在 βGU條件下能夠快速分解釋放出原藥。對(duì)于C57BL/6小鼠皮下Lewis肺癌模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，化合物5在實(shí)驗(yàn)劑量下無(wú)任何毒性反應(yīng)現(xiàn)象，小鼠耐受性良好，且抗腫瘤作用非常明顯[9]。最新的基于βGU的 PMT藥物的研究引入了血漿白蛋白結(jié)合前藥的概念(圖1中的化合物6)。含有馬來(lái)酰亞胺結(jié)構(gòu)的前藥可以與血漿白蛋白結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基Cys34中的巰醇發(fā)生偶合，從而形成一個(gè)大分子藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體。該轉(zhuǎn)運(yùn)體除了可以在腫瘤組織富集以外，由于結(jié)合了血漿白蛋白，所以還具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征[10]。在腫瘤組織中，βGU水解糖苷鍵引發(fā)自分解反應(yīng)，從而釋放原藥(見(jiàn)圖 2)。在小鼠 Lewis肺癌移植瘤模型上進(jìn)行的活性評(píng)價(jià)表明，前藥6具有與原藥多柔比星相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性，且小鼠幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的毒副作用[11]。

圖2 基于βGU應(yīng)答的阿霉素血漿蛋白結(jié)合前藥Fig.2 Antecedents of adriamycin plasma protein binding based on βGU response

盡管βGU在絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤中都有特異性表達(dá)，但在腫瘤前期病變或者小腫瘤病變中存在表達(dá)濃度相對(duì)較低的問(wèn)題，且在不同譜系腫瘤之間表達(dá)水平也存在差異。MPT前藥需要特異性表達(dá)的分子靶標(biāo)種類與藥物分子匹配，同時(shí)，達(dá)到合適的濃度范圍時(shí)，才能發(fā)揮作用。故基于βGU的MPT前藥的臨床效果也受到腫瘤細(xì)胞表面特異性分子靶標(biāo)，即 βGU表達(dá)異質(zhì)性的限制。

3 基于βGU的ADEPT前藥系統(tǒng)

抗體導(dǎo)向酶-前藥治療(Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy，簡(jiǎn)稱 ADEPT)是近年發(fā)展起來(lái)的頗具應(yīng)用前景的腫瘤導(dǎo)向治療新途徑[12,13]。其可行性理論在于，首先利用腫瘤細(xì)胞表面抗原靶向性將前藥激活酶-抗體偶聯(lián)物預(yù)先富集到腫瘤組織，再給予前藥分子，前藥經(jīng)酶解反應(yīng)釋放原藥后，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥理活性。除了表達(dá)抗體的腫瘤細(xì)胞，原藥分子還可以通過(guò)旁觀者效應(yīng)在鄰近未與抗體結(jié)合的腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥理活性。因此，ADEPT前藥體系可以有效解決腫瘤細(xì)胞表面特異性分子靶標(biāo)表達(dá)異質(zhì)性的問(wèn)題，彌補(bǔ)分子靶標(biāo)類藥物在腫瘤治療中的缺陷。

前體藥物的設(shè)計(jì)理念與MPT藥物的設(shè)計(jì)理念基本相同，包含酶識(shí)別子部分、連接子部分及原藥部分。適用于 ADEPT體系的抗體-酶偶聯(lián)物是 ADEPT前藥系統(tǒng)有別于 MPT藥物的關(guān)鍵之處，應(yīng)具有分子量小，免疫原性低，性質(zhì)穩(wěn)定，與抗原選擇性高，易清除等特點(diǎn)[14-16]，基于 βGU的抗體-酶偶聯(lián)物在實(shí)際研究中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

在ADEPT研究中，開(kāi)展最早也是應(yīng)用最多的是大腸桿菌來(lái)源的β-葡萄糖醛酸苷酶(簡(jiǎn)稱E．coli βGU)。將E．coli βGU與單克隆抗體RH1(簡(jiǎn)稱MabRH1)偶聯(lián)，聯(lián)合使用化療藥物對(duì)羥基苯胺氮芥的葡萄糖醛酸苷衍生前藥(BHAMG)，可以減緩大鼠肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)大鼠生存期。經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾后的E．coli βGU 與MabRH1偶聯(lián)得到抗體-酶偶聯(lián)物RH1-betaG-PEG，同樣可以激活A(yù)DEPT前藥分子BHAMG，釋放原藥對(duì)羥基苯胺氮芥，在肝癌大鼠模型上表現(xiàn)出明顯的治愈效果[17]。E．coli βGU 與單克隆抗體Mab323/A3偶合得到的抗體-酶偶聯(lián)物可以激活表柔比星前藥Epi-Glu，進(jìn)而選擇性地在腫瘤組織中釋放表柔比星。Epi-Glu比原藥表柔比星的毒性低100～1,000倍，并且在人血漿中穩(wěn)定性良好，因而極大地減少了化療藥物的毒副作用[18]。非人源的抗體-酶偶合物存在自身免疫性問(wèn)題，需要同步進(jìn)行免疫抑制治療。隨著蛋白工程技術(shù)的發(fā)展，利用蛋白融合技術(shù)可以得到人源葡萄糖醛酸苷酶(hβGU)與抗體的抗體-酶融合蛋白，在實(shí)驗(yàn)研究中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[19-21]。目前，較為成功的融合蛋白是針對(duì)癌胚抗原CEA的Fab anti-CEA Mab BW431- hβGU蛋白[22-23]，該融合蛋白是由hβGU及針對(duì)癌胚抗原CEA的較小的單鏈抗體片段組成。在人源腫瘤移植小鼠模型上，F(xiàn)ab anti-CEA Mab BW431- hβGU蛋白與ADEPT前藥HMR1826聯(lián)合應(yīng)用后，腫瘤組織化療藥物濃度比單獨(dú)給原藥高10倍以上，相應(yīng)的其腫瘤抑制效果也優(yōu)于單獨(dú)給藥組。

βGU作為靶向性抗腫瘤前藥的候選靶標(biāo)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：首先，βGU在廣泛的惡性腫瘤中都有高水平表達(dá)，且βGU在腫瘤細(xì)胞中被炎癥細(xì)胞外排到細(xì)胞外的壞死區(qū)域，而正常細(xì)胞的βGU則被嚴(yán)格控制在溶酶體中；其次，正常體液環(huán)境下，βGU的活性較低，僅顯示10%,的水解活性，實(shí)體腫瘤中缺氧及酸性的微環(huán)境則更適合βGU水解活性的保持；最后，人源的βGU使得ADEPT藥物的開(kāi)發(fā)減少了免疫反應(yīng)，更加適用于臨床。由此可見(jiàn)，基于βGU的PMT藥物對(duì)于較大實(shí)體腫瘤病變具有良好的研究前景。同時(shí)，ADEPT治療系統(tǒng)的發(fā)展可以進(jìn)一步提高腫瘤內(nèi)部βGU的水平，對(duì)于前期腫瘤和小腫瘤病變具有更加完備的解決措施。綜上作述，隨著藥物研發(fā)技術(shù)的完善和發(fā)展，靶向βGU的抗腫瘤藥物將有希望真正應(yīng)用到臨床實(shí)踐中。

[1]Taha M，Ismail N H，Imran S，etal. Synthesis of novel inhibitors of β-glucuronidase based on the benzothiazole skeleton and their molecular docking studies[J]. Rsc Advances，2016，6(4)：3003-3012.

[2]Tranoy-Opalinski I，Legigan T，Barat R，et al. β-Glucuronidase-responsive prodrugs for selective cancer chemotherapy：An update[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2014，74(19)：302-313.

[3]Xu Y，Liu Y，Rasool A，et al. Sequence editing strategy for improving performance of β-glucuronidase from Aspergillus terreus[J]. Chemical Engineering Science，2017(167)：145-153.

[4]Alaoui A E，Saha N，Schmidt F，et al. New Taxol(paclitaxel)prodrugs designed for ADEPT and PMT strategies in cancer chemotherapy[J]. Bioorganic& Medicinal Chemistry，2006，14(14)：5012-5019.

[5]Renoux B，Legigan T，Bensalma S，et al. A new cyclopamine glucuronide prodrug with improved kinetics of drug release[J]. Organic & Biomolecular Chemistry，2011，9(24)：8459-8464.

[6]Bensalma S，Chadeneau C，Legigan T，et al.Evaluation of cytotoxic properties of a cyclopamine glucuronide prodrug in rat glioblastoma cells and tumors[J]. Journal of Molecular Neuroscience，2015，55(1)：51-61.

[7]Gauthier C，Legault J，Rondeau S，et al. Synthesis of betulinic acid acyl glucuronide for application in anticancer prodrug monotherapy[J]. Tetrahedron Letters，2009，50(9)：988-991.

[8]Juan T Y， Roffler S R， Hou H S， et al.Antiangiogenesis targeting tumor microenvironment synergizes glucuronide prodrug antitumor activity[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2009，15(14)：4600-4611.

[9]Legigan T，Clarhaut J，Renoux B，et al. Synthesis and biological evaluations of a monomethylauristatin E glucuronide prodrug for selective cancer chemotherapy[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2013，67(17)：75-80.

[10]Graeser R，Esser N，Unger H，et al. INNO-206，the(6-maleimidocaproyl hydrazone derivative of doxorubicin)，shows superior antitumor efficacy compared to doxorubicin in different tumor xenograft models and in an orthotopic pancreas carcinoma model[J]. Investigational New Drugs，2010，28(1)：14-19.

[11]Legigan T，Clarhaut J，Renoux B，et al. Synthesis and antitumor efficacy of a β-glucuronidase-responsive albumin-binding prodrug of doxorubicin[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2012，55(9)：4516.

[12]Sharma S K，Bagshawe K D. Antibody directed enzyme prodrug therapy(ADEPT)：Trials and tribulations[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2017(139)：139.

[13]Tietze L F，Schmuck K. Prodrugs for targeted tumor therapies：recent developments in ADEPT，GDEPT and PMT[J]. Current Pharmaceutical Design，2011，17(32)：3527-3547.

[14]Osipovitch D C，Parker A S，Makokha C D，et al.Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy[J]. Protein Engineering Design &Selection Peds，2012，25(10)：613-623.

[15]Sharma S K，Bagshawe K D. Translating antibody directed enzyme prodrug therapy(ADEPT)and prospects for combination[J]. Expert Opinion on Biological Therapy，2017，17(1)：1.

[16]Wang H，Zhou X L，Long W，et al. A fusion protein of RGD4C and β-Lactamase has a favorable targeting effect in its use in antibody directed enzyme prodrug therapy[J]. International Journal of Molecular Sciences，2015，16(5)：9625.

[17]Cheng T L，Cheng C M，Chen B M，et al. Monoclonal antibody-based quantitation of poly(ethylene glycol)-derivatized proteins，liposomes，and nanoparticles[J].Bioconjugate Chemistry，2005，16(5)：1225.

[18]Rooseboom M，Commandeur J N，Vermeulen N P.Enzyme-catalyzed activation of anticancer prodrugs[J].Pharmacological Reviews，2004，56(1)：53.

[19]Xie M，Lu N N，Cheng S B，et al. Engineered decomposable multifunctional nanobioprobes for capture and release of rare cancer cells[J]. Analytical Chemistry，2014，86(9)：4618.

[20]Di Y，Ji S，Wolf P，et al. Enterolactone glucuronide and β-glucuronidase in antibody directed enzyme prodrug therapy for targeted prostate cancer cell treatment[J]. Aaps Pharmscitech，2017，18(6)：1-10.

[21]Chen K C，Wu S Y，Leu Y L. A humanized immunoenzyme with enhanced activity for glucuronide prodrug activation in the tumor microenvironment[J].Bioconjugate Chemistry，2011，22(5)：938-948.

[22]Dong B，Zhou C，Ping H，et al. A novel bispecific antibody，BiSS，with potent anti-cancer activities [J].Cancer Biology & Therapy，2016，17(4)：364-370.

[23]Shin M C，Zhang J，Min K A，et al. Combination of antibody targeting and PTD-mediated intracellular toxin delivery for colorectal cancer therapy[J]. Journal of Controlled Release，2014(194)：197-210.