常壓室溫等離子體(ARTP)誘變及高通量篩選維生素B12高產(chǎn)菌株

蔡瑩瀛 ，夏苗苗，董會(huì)娜，張同存，張大偉

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

維生素 B12(又稱鈷胺素，VB12)，是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱，也是唯一含有金屬離子的維生素．維生素 B12作為一種重要營養(yǎng)因子，廣泛應(yīng)用于飼料、食品和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域[1]，并作為人類以及哺乳類動(dòng)物自身不能合成的物質(zhì)，參與體內(nèi) DNA合成與調(diào)節(jié)、維持及產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞髓鞘、促進(jìn)血紅細(xì)胞的生成以及促進(jìn)脂肪及糖類代謝等重要的生理過程[2-3]．由于維生素B12的分子結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜、化學(xué)合成十分繁瑣導(dǎo)致效益極低，致使工業(yè)上生產(chǎn)維生素B12主要利用一些具有維生素 B12合成能力的真細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)[4-5]．目前，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素 B12有兩種常用工藝，一種是以丙酸菌(Propionibacterium)為代表的厭氧發(fā)酵工藝；另一種是以脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificans)為代表的好氧發(fā)酵工藝[6-7]．脫氮假單胞菌因發(fā)酵工藝簡便，并且在生長過程中不產(chǎn)生內(nèi)毒素和外毒素[8]，可以安全應(yīng)用于醫(yī)藥和食品添加劑工業(yè)等領(lǐng)域而備受關(guān)注，全球 80%,以上的產(chǎn)量來自該工藝發(fā)酵．

從頭合成維生素 B12的代謝途徑十分復(fù)雜，需要涉及 30余個(gè)合成基因的共同作用，并存在多條分支途徑[9]．因此，反饋調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)菌體中維生素 B12的積累具有重要作用．但到目前為止，未有詳盡的代謝工程研究來闡明合成途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制，致使通過優(yōu)化代謝途徑的方法對(duì)菌種的定向改造困難重重．至今，誘變育種的方法仍是提高微生物生產(chǎn)維生素 B12能力的高效便捷手段．相對(duì)于其他較為傳統(tǒng)的誘變技術(shù)，新型常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變育種技術(shù)在具有操作簡易且條件溫和的基礎(chǔ)上，可以達(dá)到一次誘變便能獲得 2萬個(gè)以上突變體的大庫容高效誘變[10-11]，其安全高效的特點(diǎn)使 ARTP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于獲得工業(yè)發(fā)酵高產(chǎn)菌株[12]．

高通量篩選是獲得高產(chǎn)突變株的另一關(guān)鍵步驟．目前篩選維生素 B12高產(chǎn)菌株的方法還只局限于抗性平板篩選法等傳統(tǒng)方法，隨后采用搖瓶發(fā)酵的方法對(duì)初步選出的菌株進(jìn)行大批量逐個(gè)驗(yàn)證并測定菌株維生素 B12的產(chǎn)量，采用該方法篩選誘變后的菌株會(huì)因工作量極大、發(fā)酵周期長而導(dǎo)致篩選效率低，無法做到高通量篩選．已有研究[13-14]證明，維生素 B12運(yùn)用紫外-可見分光光度計(jì)在 278、361、550,nm 處有最大吸收，且 361,nm處吸收峰形明顯，干擾因素少，可作為維生素 B12產(chǎn)量的檢測方法，但由于發(fā)酵培養(yǎng)基中成分較復(fù)雜，對(duì)此種方法造成干擾，導(dǎo)致無法采用分光光度計(jì)法直接檢測發(fā)酵液中維生素 B12的含量，只能作為粗略判斷和快速檢測的手段．

核糖開關(guān)(riboswitch)一般位于mRNA的非編碼區(qū)(UTR)，由適體結(jié)構(gòu)區(qū)域(aptamer domain，AD)和表達(dá)結(jié)構(gòu)區(qū)域(expression domain，EPD)兩部分組成[15-16]．適體區(qū)可以直接結(jié)合小分子代謝物，并能夠感知代謝產(chǎn)物的濃度變化，具有高度親和性以及特異性，當(dāng)適體區(qū)結(jié)合代謝物后自身會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，這個(gè)信息會(huì)傳遞至表達(dá)區(qū)使其形成選擇性莖環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[17]．隨著核糖開關(guān)的不斷研究，迄今已在不同細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了 200余種維生素 B12核糖開關(guān)[18]，費(fèi)式丙酸菌(Propionibacterium freudenrechii)維生素 B12合成蛋白 cbiB基因 mRNA的 5'-UTR存在高度保守序列，它能夠直接結(jié)合維生素B12的輔酶 5'-脫氧腺苷鈷胺素(5'-deoxyadenosylcobalamin，Ado-Cbl)，并抑制下游基因的表達(dá)[19]．本研究利用安全高效的 ARTP育種方法，對(duì)產(chǎn)維生素B12的脫氮假單胞菌進(jìn)行誘變育種，隨后配合微孔板培養(yǎng)發(fā)酵以及核糖開關(guān)這一感應(yīng)元件做到高通量篩選，并采用與酶標(biāo)儀相結(jié)合的快速檢測方法，建立高通量篩選高產(chǎn)維生素 B12突變體的流程，獲得了穩(wěn)定高產(chǎn)維生素B12的突變株．

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

維生素 B12生產(chǎn)菌株脫氮假單胞菌(P．denitrificans)PA320、低產(chǎn)維生素 B12菌株脫氮假單胞菌 PA320-L、無維生素 B12生產(chǎn)能力菌株脫氮假單胞菌 PA320-Z、大腸桿菌(E．coli)DH5α、費(fèi)式丙酸菌(P．freudenreichii)及所用大腸桿菌-脫氮假單胞菌穿梭質(zhì)粒pBHR1(耐卡那霉素)、pBBR1MCS-A(耐氨芐青霉素)均為本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿 50，葡萄糖 20，(NH4)2,SO42.0，K2HPO48.0，瓊脂 20；pH 7.0～7.2．

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿 50，葡萄糖 20，CoCl2·6H2O 0.15，(NH4)2SO42.0，K2HPO48.0；pH 7.0～7.2．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿 50，葡萄糖 20，CoCl2·6H2O 0.15 ，ZnSO4·7H2O 0.1 ，DMBI 0.1 ，(NH4)2SO42.0，K2HPO48.0；pH 7.0～7.2．

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 120，CoCl2·6H2O 0.3，DMBI 0.3．

1.3 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶，Thermo Fisher Scientific公司；DNA聚合酶PrimerSTAR Mix，Takara公司；2×Taq PCR MasterMix，北京天根生化科技有限公司；氰鈷胺素，Sigma公司；基因 組DNA提取試劑盒(DP302-02)、質(zhì)粒小提試劑盒(D6943-02)、膠回收試劑盒和柱式 PCR產(chǎn)物純化試劑盒(D6492-02)，OMEGA公司，由金唯智公司進(jìn)行引物合成和測序；亞硝酸鈉、乙腈、冰醋酸、異丙醇等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純．

ARTP型常壓室溫等離子體誘變育種儀，北京思清源生物科技有限公司；Spectra Max M5型連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美國 Molecular Devices公司；2WY-2112B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜分析儀，安捷倫科技有限公司；5810R型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PTC-1148型 PCR儀，美國 Bio-Rad公司；V-1600型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 基因克隆與構(gòu)建表達(dá)菌株

提取費(fèi)式丙酸菌(P．freudenrechii)基因組總DNA為模板，使用Ribo-F(TGTACTAGGGTCAATG TGCTGG)和Ribo-R(CTCGGACAAGAACCTCAAA TCCACG)為引物 PCR擴(kuò)增出基因組上 213,bp的Riboswitch片段，與已擴(kuò)增出的 5'端包含 20～30,bp重疊末端的LacI片段(使用引物lacI-F：CGTGGATT TGAGGTTCTTGTCC GTGAAACCAGTAACGTTAT ACGAT，lacI-R：TGAATCCGTAATCATGGTCAT AGC擴(kuò)增，劃線處為同源片段)運(yùn)用Overlap PCR技術(shù)擴(kuò)增出兩者相連接的 DNA多聚體，并與表達(dá)載體pBHR1運(yùn)用 Gibson assembly技術(shù)連接[20]，轉(zhuǎn)化入E．coli DH5α感受態(tài)中，得到重組質(zhì)粒 pBHR1-r(P)-lacI后送陽性克隆到公司測序，另一重組質(zhì)粒也以上述方法構(gòu)建．均構(gòu)建完成后將兩重組質(zhì)粒按照三親本轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入脫氮假單胞菌(P．denitrificans)中．

1.4.2 ARTP誘變條件的確立

樣品制備：將脫氮假單胞菌(P．denitrificans)PA320于固體培養(yǎng)基上活化，置于30,℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48,h．待長出單菌落后，挑取單菌落接種于含5,mL種子培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(A600＝2.0)，取1,mL菌液，用無菌生理鹽水沖洗2次，再用2,mL含 10%,甘油的無菌生理鹽水重懸，取 10,μL處理好的樣品準(zhǔn)備進(jìn)行ARTP誘變．

照射劑量的確定：取10,μL上述處理好的菌體均勻涂布在已經(jīng)滅菌的載片上，將 ARTP誘變儀器的功率設(shè)置為100,W，使載片與射流出口的距離設(shè)置為4,mm，氣體流量為 10,L/min．選擇照射時(shí)間分別為0、15、30、60、90、120,s．將上述經(jīng)過等離子誘變體照射過的帶有菌體的載片迅速放入裝有 1,mL 的生理鹽水中，渦旋振蕩 1,min．取已經(jīng)振蕩的菌液稀釋涂平板，放入 30,℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2,d．經(jīng)上述條件培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)各平板上單菌落個(gè)數(shù)，取 3次平均值，繪制出致死率曲線．

1.4.3 高通量篩選模型建立

為了高效并快速篩選到高產(chǎn)維生素 B12的突變菌株，建立核糖開關(guān)高通量篩選方法與 48孔板通量發(fā)酵相結(jié)合的篩選方法(圖1)．將ARTP誘變后的菌液混合培養(yǎng)，取200,μL菌液用無菌PBS沖洗3次后重懸稀釋至 106,mL-1，所制得的樣品采用流式細(xì)胞儀分選熒光值較高的前 1%,的細(xì)胞，為保證存活率將每3個(gè)單菌分選至48孔板的1個(gè)孔中發(fā)酵培養(yǎng)6,d，取發(fā)酵液進(jìn)行處理后檢測其361,nm下吸光度以判斷維生素B12的產(chǎn)量，最后通過搖瓶發(fā)酵并采用HPLC檢測初篩得到的突變菌株維生素B12產(chǎn)量．

圖1 脫氮假單胞菌ARTP誘變篩選流程Fig. 1 ARTP mutagenesis and screening process of Pseudomonas denitrifican

1.4.4 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵條件

固體培養(yǎng)基配制：按照培養(yǎng)基配方中平板培養(yǎng)基的成分，配制固體培養(yǎng)基，每個(gè)平板所需培養(yǎng)基約為30,mL，待平板凝固以后置于4,℃冰箱備用．

菌種培養(yǎng)：將保藏好的甘油管菌種蘸取少量菌液涂布于固體培養(yǎng)基上，置于 30,℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48,h．待長出單菌落之后，挑取單菌落接種于含30,mL種子培養(yǎng)基的 250,mL三角瓶中，30,℃振蕩(220,r/min)培養(yǎng) 36,h．將種子培養(yǎng)基按 10%,比例接種至含30,mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中. 30,℃振蕩(220,r/min)培養(yǎng)，分別于72、48、120,h加補(bǔ)料培養(yǎng)基 3,mL，繼續(xù)培養(yǎng) 144,h后收集菌體并檢測維生素B12產(chǎn)量．

1.4.5 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

在固體培養(yǎng)基平板上活化篩選出高產(chǎn)維生素B12的菌株，將其轉(zhuǎn)移到液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)種子液培養(yǎng)，并連續(xù)轉(zhuǎn)移數(shù)次，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，比較突變株產(chǎn)維生素B12能力的穩(wěn)定性．

1.5 維生素B12含量的測定方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精確稱取1,mg 標(biāo)準(zhǔn)品溶解于1,mL超純水中制備成母液，逐漸稀釋為 0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2,g/L的樣品．

1.5.2 分光光度計(jì)法

分別將上述稀釋不同倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理，并測定其波長 361,nm 下的吸光度，繪制維生素 B12質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此曲線(y＝0.016,5,x+0.166,6，R2＝0.987,3)和稀釋倍數(shù)即可計(jì)算出發(fā)酵液中維生素B12質(zhì)量濃度．

1.5.3 HPLC測定法

發(fā)酵液預(yù)處理：吸取 發(fā)酵液 10,mL，加入 2.5,mL 8%,亞硝酸鈉溶液和冰醋酸2.5,mL，混勻后置于 95～100,℃水浴反應(yīng) 30,min，冷卻至室溫后用水定容至50,mL，10,000,r/min離心 1,min后取上清液，并用0.22,μm 微孔濾膜過濾．取濾液 1,mL，加入 2%,氰化鈉溶液 20,μL，置 35～40,℃恒溫反應(yīng) 1,h，使被測樣品中不同形式的鈷胺素均轉(zhuǎn)化為氰鈷胺，最終取20,μL用于HPLC測定其含量．

HPLC檢測條件：C18-250A色譜柱(4.6,mm×250,mm，5,μm)，流動(dòng)相Ⅰ為 KH2PO4溶液(50,mmol/L，pH 3.0)，流動(dòng)相Ⅱ?yàn)橐译妫疵摋l件：0～5,min，10%,乙腈恒速洗脫；5～15,min，10%,～20%,乙腈梯度洗脫；15～20,min，20%,乙腈恒速洗脫．吸收波長為 361,nm，柱溫為 35,℃，流量0.8,mL/min，進(jìn)樣量 20,μL．

2 結(jié)果與分析

2.1 核糖開關(guān)實(shí)用性的驗(yàn)證

維生素 B12濃度依賴的核糖開關(guān) cbiB是一種抑制型的核糖開關(guān)，當(dāng)維生素 B12濃度逐漸升高時(shí)，與其相連的下游基因表達(dá)受到抑制作用，因此該核糖開關(guān)下游綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度會(huì)隨維生素 B12濃度的升高而降低，這樣不利于篩選方法的建立．為解決此問題，設(shè)計(jì)核糖開關(guān)PF-cbiB雙質(zhì)粒篩選元件的構(gòu)建，如圖2所示．將其與編碼阻遏蛋白的 lacI基因相結(jié)合，即不存在代謝產(chǎn)物維生素 B12時(shí)，核糖開關(guān)形成抗終止子，表達(dá)下游阻遏蛋白的基因lacI、lacI與lacO結(jié)合后，GFP報(bào)告基因無法表達(dá)；存在代謝產(chǎn)物維生素B12時(shí)，核糖開關(guān)形成終止子，抑制阻遏蛋白 lacI的產(chǎn)生，GFP報(bào)告基因可表達(dá)(圖2)．

圖2 核糖開關(guān)PF-cbiB雙質(zhì)粒篩選元件構(gòu)建示意圖Fig. 2 Filter components construction of the double plasmid of riboswitch PF-cbiB

將上述所構(gòu)建的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入不同產(chǎn)量的菌株中，在熒光顯微鏡下可直觀觀察熒光報(bào)告基因表達(dá)情況的差異性(圖 3)．由圖 3可知：無維生素 B12生成的菌株 PA320-Z在熒光顯微鏡下極少數(shù)單菌落呈現(xiàn)極其微弱的熒光強(qiáng)度，其他菌落均無熒光強(qiáng)度檢出；低產(chǎn)維生素 B12的菌株 PA320-L及高產(chǎn)維生素 B12的菌株 PA320在熒光顯微鏡下，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)隨維生素 B12濃度的升高，熒光強(qiáng)度明顯上升的趨勢．結(jié)果表明優(yōu)化后的維生素B12篩選元可滿足維生素B12與熒光強(qiáng)度成正比的需求．

圖3 不同產(chǎn)量菌株的熒光強(qiáng)度Fig. 3 Fluorescence intensity of strains of different yield

運(yùn)用模擬篩選實(shí)驗(yàn)的條件進(jìn)一步驗(yàn)證維生素B12篩選元件實(shí)用性．按同吸光度比例對(duì) 3菌株的發(fā)酵菌進(jìn)行稀釋，并采用流式細(xì)胞儀分選前 1%,的混菌，所分選的結(jié)果用 Summit 5.2軟件分析，其中高產(chǎn)菌株P(guān)A320占混菌的81.6%,(圖4)，結(jié)果表明此篩選元件篩選陽性率較高，可作為誘變后高通量篩選的方法，將含有此元件的誘變出發(fā)菌株命名為 PA320-Mybi．

圖4 流式細(xì)胞儀驗(yàn)證核糖開關(guān)PF-cbiB的可用性Fig. 4 Availability of riboswitch PF-cbiB verified by flow cytometry

2.2 ARTP誘變致死率曲線的測定

采用平板活菌計(jì)數(shù)的方法，按照 1.4.2節(jié)對(duì)脫氮假單胞菌的致死率進(jìn)行測定，結(jié)果如圖 5所示，ARTP處理 30,s脫氮假單胞菌致死率達(dá)到 80%,，處理60,s后致死率穩(wěn)定在85%,左右，當(dāng)處理時(shí)間120,s時(shí)，致死率接近100%,，故選取ARTP處理時(shí)間75,s，致死率90%,左右作為后續(xù)處理的條件．

圖5 脫氮假單胞菌的ARTP致死率曲線Fig. 5 ARTP lethal rate curve of P. denitrificans

2.3 裝液量、培養(yǎng)基對(duì)突變株發(fā)酵的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)采用種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行 48孔板發(fā)酵時(shí)，當(dāng)裝液量為 1.0,mL、培養(yǎng)溫度30,℃、400,r/min的條件下，培養(yǎng)6,d后通過HPLC測量維生素B12產(chǎn)量為20～30,mg/L，發(fā)酵產(chǎn)量較低的情況下會(huì)造成孔板產(chǎn)量不能準(zhǔn)確反映菌株生產(chǎn)性能的情況．分析造成此情況的原因可能是：首先，在發(fā)酵產(chǎn)維生素 B12過程中，脫氮假單胞菌對(duì)氧的需求量較大，48孔板容量體積較小，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)速固定的情況下，孔板裝液量成為影響溶氧的較大因素；其次，在培養(yǎng)基的選擇上也尤為關(guān)鍵，若單獨(dú)采用種子培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，雖菌種生長速度快，但會(huì)導(dǎo)致后期營養(yǎng)成分不足而造成產(chǎn)量偏低的情況，而單獨(dú)采用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，會(huì)導(dǎo)致菌種生長較為緩慢的情況．因此，對(duì)48孔板發(fā)酵裝液量和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高孔板發(fā)酵的篩選的可靠性，結(jié)果如圖6所示．

圖6 培養(yǎng)基和裝液量對(duì)菌株 48孔板維生素 B12產(chǎn)量的影響Fig. 6 Influence of medium and its volume on VB12yield in 48 deep-well microliters plate

由圖 6可知：裝液量和培養(yǎng)基種類對(duì) 48孔板中維生素B12的產(chǎn)量有極顯著影響，裝液量為0.50,mL，采用混合培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)維生素 B12產(chǎn)量提高最顯著，培養(yǎng)6,d產(chǎn)量可達(dá)(44.98±1.20)mg/L，分別是在同樣裝液量的情況下單獨(dú)采用種子培養(yǎng)基(維生素 B12產(chǎn)量為 21.45,mg/L)的 2.09倍及同條件下單獨(dú)采用發(fā)酵培養(yǎng)基(維生素 B12產(chǎn)量為 23.05,mg/L)的 1.95倍．經(jīng)條件優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：混合培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，孔板裝液量為 0.50,mL，培養(yǎng)溫度為 30,℃，轉(zhuǎn)速為400,r/min，培養(yǎng)時(shí)間為6,d．

為證明優(yōu)化發(fā)酵條件后突變株在48孔板發(fā)酵與搖瓶發(fā)酵之間的相關(guān)性，挑選在 361,nm 下呈現(xiàn)不同吸光度的30個(gè)誘變后單菌落進(jìn)行48孔板發(fā)酵，同時(shí)將這30個(gè)單菌落按照1.4.4方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并分別測定維生素 B12的產(chǎn)量，對(duì)測得的數(shù)值進(jìn)行回歸方程分析(圖 7)，所得結(jié)果為本實(shí)驗(yàn)建立的高通量篩選方法的可靠性作驗(yàn)證．

圖7 48孔板發(fā)酵與250,mL搖瓶發(fā)酵的相關(guān)性Fig. 7 Correlation between fermentation in 48,microliters plate and fermentation in 250,mL flask

2.4 突變育種篩選結(jié)果

2.4.1 誘變突變株的初篩

取48孔板培養(yǎng)6,d的發(fā)酵液按照 1.4.3方法進(jìn)行處理，檢測其 361,nm 下吸光度來篩選高產(chǎn)維生素B12的突變菌株，并將快速檢測后篩選得到的突變菌株發(fā)酵液按照HPLC方法檢測其維生素B12產(chǎn)量．經(jīng)1.4.3方法對(duì)初始菌株P(guān)A320進(jìn)行4輪ARTP誘變篩選，結(jié)果如圖8所示．初篩得到6株維生素B12相對(duì)產(chǎn)量提高 20%,以上的突變株，對(duì)這 6株突變株(4-1B1、4-1D1、4-1D3、4-2E5、4-2F3 和 4-2H2)進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)．

圖8 ARTP誘變篩選菌株48孔板發(fā)酵維生素B12產(chǎn)量Fig. 8 VB12 concentration of 48 microliters plate fermentation mutants obtained through ARTP treatments

2.4.2 誘變突變株的復(fù)篩

取出發(fā)菌株及通過初篩得到的 6株突變菌株進(jìn)行 250,mL搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，30,℃、220,r/min發(fā)酵培養(yǎng)，并采用 HPLC檢測菌株發(fā)酵 144,h后維生素B12產(chǎn)量，如圖9所示．在ARTP誘變及高通量篩選得到的 6株突變株中，3株(4-1D1、4-2E5和 4-1B1)相對(duì)產(chǎn)量提高了 20%,，且 PA320-M4-1B1突變株維生素B12產(chǎn)量高達(dá)(103.2±2.1)mg/L，較初始菌株 PA320的維生素B12產(chǎn)量(71.9±1.8)mg/L提高了43.8%．對(duì)維生素 B12產(chǎn)量提高 20%,以上的 3株突變株進(jìn)行后續(xù)遺傳性狀測定實(shí)驗(yàn)．

圖9 初篩所得突變菌株搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證Fig. 9 Shake flask fermentation validation of screening of mutant strains

2.4.3 遺傳穩(wěn)定性分析

對(duì)篩選所得高產(chǎn)突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)，將突變株4-1D1、4-2E5和4-1B1進(jìn)行8代連續(xù)傳代培養(yǎng)，并檢測 1、2、4、6、8代搖瓶發(fā)酵液的維生素 B12產(chǎn)量，測定結(jié)果見表 2．由表 2可知：隨傳代次數(shù)的增加，菌株生產(chǎn)維生素 B12的能力無明顯變化，直至經(jīng)8次傳代后也較為穩(wěn)定．結(jié)果表明本研究經(jīng)ARTP誘變獲得的高產(chǎn)突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性．

表2 突變株的遺傳穩(wěn)定性分析Tab. 2 Analysis of the genetic stability of the mutant strains

3 結(jié) 論

ARTP誘變系統(tǒng)能夠快速高效的誘變維生素B12生產(chǎn)菌株脫氮假單胞菌(P．denitrificans)，而且突變效果良好．利用核糖開關(guān)作為感應(yīng)元件結(jié)合流式細(xì)胞儀高通量分選誘變后特征菌株，48孔板培養(yǎng)發(fā)酵后維生素B12分光光度計(jì)法在361,nm下吸光度為指標(biāo)快速檢測初篩菌株的維生素 B12產(chǎn)量，建立一套完整高效的高通量篩選方法．通過 4輪 ARTP誘變及篩選，獲得了4-1D1、4-2E5和4-1B1這3株突變株，維生素B12產(chǎn)量均提高20%,以上且遺傳性能穩(wěn)定，其中PA320-M4-1B1在250,mL搖瓶發(fā)酵6,d的條件下維生素 B12產(chǎn)量達(dá)到(103.2±2.1)mg/L，較初始菌株P(guān)A320的維生素 B12產(chǎn)量(71.9±1.8)mg/L提高了43.8%,．此方法的建立也為今后研究維生素 B12以及其他維生素家族的高通量篩選提供了參考．

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