姜黃素在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中的抗氧化應(yīng)激作用

梁 嵐，韋會平，孫 妍，田金鳳

(攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)整合醫(yī)學(xué)教研室，四川 攀枝花 617000)

姜黃素是一種從姜科姜黃屬植物—姜黃的根莖提取物中分離得到的天然色素，純品姜黃素為黃色結(jié)晶狀的粉末，其分子量大小為368.38，用分子式C21H20O6來表示。姜黃素屬于多酚類化合物，其脂溶性好，易通過血腦屏障，性質(zhì)穩(wěn)定[1-2]。在我國姜黃素的臨床藥用歷史悠久，臨床上常用于治療鼻炎、鼻竇炎、呼吸道疾病等[2]。近年來對姜黃的活性成分研究顯示：姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，姜黃素可顯著抑制大腦因缺血或再灌注引起的黃嘌呤氧化酶、過氧化陰離子、過氧化歧化酶、乳酸脫氫酶等的生成，且該過程與核因子E2轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)通路的激活密切相關(guān)，姜黃素的抗氧化應(yīng)激作用可降低腦組織所受的損傷及二次損傷起到保護腦組織的作用[3-6]，但是姜黃素在創(chuàng)傷性腦損傷中是否也有抗氧應(yīng)激的作用，目前尚不明確。創(chuàng)傷性腦損傷又稱腦外傷或腦損傷(traumatic brain injury，TBI)，是指由于機械性沖擊(穿透力、鈍擊力、加速力、減速力等)所致的顱腦外傷，包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷。繼發(fā)性腦損傷常引起體內(nèi)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等，促使繼發(fā)性生化降解發(fā)生，進一步加重腦損傷程度[7]。腦外傷常引起患者的嚴(yán)重癱瘓或智力損傷，其致傷率、致殘率和致死率都很高[8]。鑒于姜黃素在缺血或再灌注腦損傷中的保護作用，本研究擬通過構(gòu)建大鼠腦創(chuàng)傷模型，研究姜黃素對腦損傷組織中Nrf2以及抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達、含量或活性的影響，以期望闡明姜黃素發(fā)揮腦損傷保護作用的分子機制，為姜黃素用于創(chuàng)傷性腦損傷的臨床治療提供更多的理論支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠20只，體重260～280 g，4～8周齡，由成都達碩實驗動物有限公司提供[SCXK(川)2013-024]，實驗在攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗室完成[SYXK(川)2011-178]。本動物實驗的研究方案已獲得攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號：201504523，且所有實驗過程均符合動物倫理學(xué)和動物福利。

1.2 主要試劑及儀器

姜黃素液(美國，Sigma公司)按2 g/mL溶于二甲基亞砜(DMSO)后保存于4℃冰箱，使用時應(yīng)用生理鹽水稀釋2000倍成1 mg/mL[9]；Trizol試劑(美國，Invitrogen公司)；TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國，Life Technologies公司)；定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR)試劑盒(美國，GeneCopoeia公司)；免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢，博士德公司)；水合氯醛(天津，永大化學(xué)制劑公司)；兔抗鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗鼠β-catin抗體(美國，CST公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量檢測試劑盒(南京，建成生物工程研究所)；血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)ELISA檢測試劑盒、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inductive nitric oxide synthase，iNOS)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(上海，上海滬震生物科技)。

紫外可見分光光度計(美國，Thermo公司，Nanodrop 2000)；FS-1型電動勻漿器(江蘇，新瑞儀器)；自由落體式腦外傷造模裝置(上海，醫(yī)用儀器廠)；分析天平(上海，光學(xué)儀器廠)；Bio Rad IQ5實時熒光定量PCR儀(美國，Bio Rad)；Epoch超微量微孔板分光光度計(美國，BioTek)；高級研究型顯微鏡NIKON Eclipse 80i(日本，尼康)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將SPF級SD雄性大鼠20只隨機分成四組，分別為正常對照組，腦損傷模型組(TBI)，腦損傷溶劑組(TBI+S)，腦損傷姜黃素處理組(TBI+C)，每組各5只。

1.3.2 大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立

在大鼠腦外傷動物模型制作前，將大鼠放入乙醚麻醉罐中麻醉，將大鼠俯臥捆綁并固定。其中大鼠頭部置于海綿墊上，在大鼠蘇醒有肢體活動時，使用500 g砝碼從造模裝置的55 cm立柱標(biāo)尺處自由墜落(砝碼方向豎直、對準(zhǔn)大鼠頭部正中)[10]。大鼠腦外傷模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠四肢活動不協(xié)調(diào)，行動遲緩，部分大鼠出現(xiàn)鼻/口腔出血，經(jīng)觀察和鑒定，該實驗中所用的腦損傷大鼠均造模成功，繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

正常對照組僅給予麻醉和生理鹽水處理。TBI組、TBI+S組和TBI+C組均采用自由落體式腦外傷造模裝置進行造模，造模成功后，TBI+C組腹腔注射姜黃素5 mg/kg(2 g/mL的母液用生理鹽水稀釋成1 mg/mL)，TBI+S組腹腔注射DMSO溶劑(DMSO原液用生理鹽水稀釋2000倍，即0.05%)，TBI組給予等量的生理鹽水處理。1 d后處死所有大鼠并取腦組織，迅速于-80℃凍存，以用于后續(xù)的RNA和蛋白提取。另外取大鼠大腦皮層腦組織標(biāo)本保存于4%多聚甲醛中，4℃冰箱保存以用于后續(xù)免疫組化檢測。

1.3.3 RNA提取和純度/濃度檢測

操作中使用的所有器皿、試劑和材料均經(jīng)160℃高溫消毒。取液氮中保存的組織樣品，于分析天平上各稱取100 mg，置于2 mL的EP管中，每份樣本中分別加入700 μL的TRIzol試劑，研磨充分后室溫放置5 min，加入140 μL的氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min 后12 000 r/min，4℃離心15 min。將上層液體吸出并轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入Trizol試劑2倍體積的異丙醇，混勻后靜置10 min，離心去上清。1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)速7500 r/min，4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μL無酶雙蒸水溶解，取1 μL測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將分裝出的1 μL總RNA用于濃度測定，紫外可見分光光度計用于檢測A260/A280值，其中取1 μL無酶水用作空白校對，當(dāng)A260/A280<3時，可進行RNA濃度檢測。樣本RNA濃度檢測前可簡單離心，分別記錄所測的RNA濃度值和A260/280值。當(dāng)A260/A280=1.8～2.0時，RNA濃度適中，可用于后續(xù)qRT-PCR實驗。

1.3.4 qRT-PCR檢測

以1.3.3中提取的組織RNA為模板，按TaqMan的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，按GeneCopoeia公司的qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，檢測設(shè)備為Bio Rad IQ5實時熒光定量PCR儀。所有引物均由美國Invitrogen公司合成。Nrf2上游引物：5′-TTCCTCT GCTGCCATTAGTCAGT-3′，下游引物：5′-GCTCTTC CATTTCCGAGTCACT-3′，擴增片段長度為215 bp，以β-actin為檢測內(nèi)參，2-ΔΔCT用于計算相對表達量。反應(yīng)體系為20 μL，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.5 組織蛋白的提取

將切除的大鼠腦組織塊迅速置于預(yù)冷生理鹽水中漂洗，將組織切成小塊(200 mg～1 g之間)，分析天平上稱重，加入組織質(zhì)量數(shù)值10倍的哺乳動物組織總蛋白提取試劑(提前按比例加入酶抑制劑)，在組織勻漿器中均漿，將組織研磨完全。隨后進行超聲處理，冰上裂解4～5 h，10 000 r/min離心10 min，取中層溶液，加入等體積的蛋白上樣緩沖液(稀釋2倍)，隨后置于100℃水浴箱沸水浴中變性5 min，分裝到-80℃中保存。

1.3.6 Western Blot檢測

按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行操作，鑒定蛋白濃度。每組分別取30 μg樣本，進行10%的SDS-PAGE凝膠電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶2000的兔抗鼠Nrf2多克隆抗體和1∶1000兔抗鼠β-catin抗體，4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶10 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描并保存條帶圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白的條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin的蛋白灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達水平，每組實驗設(shè)置三個復(fù)孔。

1.3.7 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測

分析天平上分別稱取各組大鼠腦組織100 mg，放入干凈的勻漿管中，加入預(yù)冷的生理鹽水(0.9%，腦組織體積的10倍)，迅速用眼科剪將組織剪碎，勻漿器上勻漿(冰上)，2000 r/min離心5～10 min，收集上清液，-20℃中保存?zhèn)溆?。分別按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行操作，通過化學(xué)比色法檢測大鼠腦組織中MDA和GSH的含量、SOD和CAT的活力。

1.3.8 腦組織中HO-1和iNOS活力檢測

分析天平上稱取大鼠腦組織100 mg，加入10倍體積預(yù)冷0.9%生理鹽水，迅速用眼科剪將組織剪碎，勻漿器上勻漿(冰上)，2000 r/min離心10 min，收集上清液。按照HO-1和iNOS的ELISA試劑盒說明書進行操作，首先對標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔(無酶標(biāo)試劑)、樣品孔。分別為標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入酶標(biāo)包被板，40 μL樣品稀釋液加入待測樣品孔，待測樣品10 μL，封板后37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 min。將濃縮洗滌液稀釋30倍以備用，揭去封板膜，棄液體甩干，加洗滌液靜置30 s，棄洗滌液，重復(fù)5次，甩干，加酶標(biāo)試劑，每孔500 μL，空白孔，不加，37℃孵育3 min，洗滌液洗滌，加入顯色劑(A液50 μL，B液50 μL，將A液和B液混勻)。37℃錫箔紙避光后顯色15 min。顯色結(jié)束后向每孔加入50 μL的反應(yīng)終止液。超微量微孔板分光光度計用以檢測吸光度(OD值，波長450 nm)，并設(shè)置空白調(diào)零孔。實驗數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)物濃度，縱坐標(biāo)-OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測的樣品OD值所對應(yīng)的濃度，實際濃度為對應(yīng)濃度值乘以稀釋倍數(shù)，根據(jù)說明書提供的公式計算大鼠腦組織勻漿液中HO-1、iNOS的活力。

1.3.9 免疫組化檢測Nrf2的表達

PBS沖洗，共3次，每次5 min，加顯色劑(配置方法：1 mL水中1滴顯色劑A，1滴顯色劑B，1滴顯色劑C)混勻，清水沖洗10 min后，蘇木精復(fù)染，水中沖洗干凈切片，依次放入70%無水乙醇，80%無水乙醇，95%無水乙醇，100%無水乙醇-二甲苯，二甲苯。各2 min，將切片置于通風(fēng)櫥中，中性樹膠封片晾干，顯微鏡下采集圖像(×200)，Nrf2蛋白表達的定性研究采用直接觀察是否核表達，根據(jù)陽性細胞在全部組織細胞中所占比例和陽性細胞染色強度判定實驗結(jié)果∶A∶按顯色細胞數(shù)記分，陽性細胞數(shù)<1/3為1分，陽性細胞數(shù)1/3～2/3為2分，陽性細胞數(shù)>2/3為3分。 B∶按細胞顯色深淺記分，無陽性反應(yīng)細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)=A×B。A×B=0判斷為(-)，A×B=1～2判斷為(+)，A×B=3～4為(++)，A×B=5～9為(+++)，該半定量評分由我院三位病理科技術(shù)人員共同閱片打分，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Nrf2在腦組織中的mRNA和蛋白表達

四組腦組織中Nrf2的mRNA和蛋白表達水平整體比較,差異均有顯著性(P<0.05)。與正常對照組比較，TBI 組、TBI+S 組腦組織中Nrf2 mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與TBI組及TBI+S組比較，TBI+C組腦組織中Nrf2mRNA和蛋白表達水平則明顯降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。Nrf2 蛋白表達水平見圖1A，Nrf2 mRNA表達水平見圖1B，數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 Nrf2在腦組織中的mRNA和蛋白表達(n=5)Tab.1 Expressions of Nrf2 mRNA and protein in the brain tissues

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group,#P<0.05.

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖1 QRT-PCR和West Blot檢測Nrf2的mRNA和蛋白表達水平 Note.Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group, #P<0.05.Fig.1 Expresssion levels of Nrf2 mRNA and protein detected by qRT-PCR and West blot

2.2 腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性變化

四組腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性整體比較，差異均有顯著性(P<0.05)。與正常對照組比較，TBI組和TBI+S組腦組織中SOD、CAT活性，GSH的含量顯著降低，而MDA的含量顯著增加(P<0.05)。與TBI組、TBI+S組比較，TBI+C組的腦組織中SOD、CAT活性，GSH的含量顯著增加(P<0.05)，而MDA的含量顯著降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2和表2。即姜黃素治療可使腦損傷組織中SOD和CAT活性，GSH含量增加，MDA含量降低，逆轉(zhuǎn)腦損傷所致的抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的改變趨勢。

2.3 腦組織中HO-1和iNOS含量變化

四組腦組織中HO-1和iNOS含量整體比較，差異均有顯著性(P<0.05)。與正常對照組相比，TBI組和TBI+S組腦組織中HO-1和iNOS的含量均顯著增加(P<0.05)。與TBI組、TBI+S組比較，TBI+C組腦組織的HO-1和iNOS含量顯著降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3和表3。即姜黃素可逆轉(zhuǎn)腦外傷所致的HO-1和iNOS的含量增加。

表2 腦外傷對大鼠腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性的影響(n=5)Tab.2 Effects of traumatic brain injury on the content/activity of MDA, GSH，SOD and CAT in the rat brain tissues

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖2 腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT含量/活性比較Note.Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group, #P<0.05.Fig.2 Comparison of the contents of MDA, SOD and CAT in the brain tissues

組別GroupsHO-1(Pg/mg)iNOS(ng/mg)正常對照組Controlgroup186.20±0.7266.68±3.46TBI組TBIgroup293.42±3.19*199.37±3.48*TBI+S組TBI+Sgroup287.22±5.02*202.83±4.78*TBI+C組TBI+Cgroup191.17±3.27#95.28±3.18#F1483.0111734.844P0.0000.000

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖3 腦組織中HO-1和iNOS含量變化Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.Fig.3 Changes of HO-1 and iNOS contents in the brain tissues

2.4 免疫組化檢測Nrf2表達

四組腦組織中Nrf2的蛋白表達整體比較，差異有顯著性(P<0.05)。與正常對照組相比，TBI組和TBI+S組腦組織中Nrf2的蛋白表達顯著增強(P<0.05)；與TBI組、TBI+S組相比，TBI+C組的Nrf2的蛋白表達則明顯降低(P<0.05)，而TBI組與TBI+S組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表4及圖4。

客戶服務(wù)代表、銷售代表、供應(yīng)鏈專業(yè)人員、市場專員，他們從“數(shù)據(jù)分析”中獲得的信息都是不一樣的，據(jù)此安排的活動和獲得的結(jié)果也是因人而異。當(dāng)為商業(yè)問題提供一個“數(shù)據(jù)分析”解決方案時，需要將客戶作為考慮的和規(guī)劃優(yōu)化用戶重點。

表4 免疫組化檢測腦組織中的Nrf2表達(n=5)Tab.4 Immunohistochemical detection of Nrf2 expression in the brain tissues

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。

Note.Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group，#P<0.05.

3 討論

注：腦組織切片：A：正常對照組，B：TBI組，C：TBI+S組，D：TBI+C組4組大鼠的切片。淺黃色、棕黃色或棕褐色部位為Nrf2核表達的陽性細胞，藍色部位為細胞核染色。與正常對照組比較，*P<0.05；與 TBI組、TBI+S組比較，#P<0.05。圖4 免疫組織化學(xué)檢測Nrf2蛋白的表達水平(×400)Note.Brain tissues from a rat of the control group (A), TBI group (B), TBI+S group (C) and TBI+C group (D). Pale yellow, pale brown and brown colors indicate the positive cells with nuclear expression of Nrf2. Compared with the control group，*P<0.05. Compared with the TBI group and TBI+S group, #P<0.05.Fig.4 Immunohistochemical detection of expression levels of Nrf2 protein in the brain tissues

姜黃素是從姜黃和莪術(shù)等植物根莖中分離純化后得到的一種黃色粉末，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，脂溶性強，體內(nèi)代謝迅速，藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，臨床常用于治療鼻炎，鼻竇炎，呼吸道疾病等[3-6]。由于姜黃素口服時存在首關(guān)效應(yīng)及代謝迅速的現(xiàn)象，其生物利用度較低，因此臨床上姜黃素多用于治療腸道疾病[11]。近年來，有大量研究報道顯示姜黃素對改善急性腎損傷、缺氧或缺血性腦損傷、腦損傷后的炎癥反應(yīng)、大腦因缺血或再灌注引起的腦損傷等有很好的療效，但姜黃素發(fā)揮腦損傷保護作用的分子機制仍不明確[12-13]。

腦外傷是機械性外力所致的顱腦創(chuàng)傷，可對患者的生理和心理造成嚴(yán)重?fù)p傷，其致死和致殘率極高[14]。研究顯示氧化應(yīng)激在腦外傷康復(fù)中發(fā)揮著重要的作用，腦外傷導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧，期間活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量產(chǎn)生，ROS產(chǎn)生量大于機體可承受的抗氧化能力后，機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，保護損壞組織[15-16]。人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)易發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使神經(jīng)元受損傷，此時中樞神經(jīng)系統(tǒng)可調(diào)用內(nèi)源性抗氧化酶防御體系，維持細胞內(nèi)氧化還原平衡，保護神經(jīng)元免受損傷[17-18]。人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)分兩種。一種為抗氧化酶類，如SOD、CAT等。一種為非酶性抗氧化劑，如還原性GSH、MDA等[19-20]。本研究中我們檢測了腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT的含量/活力變化，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，TBI組和TBI+S組腦組織中SOD和CAT活性，GSH的含量顯著降低，而MDA的含量顯著增加(P<0.05)，而姜黃素可逆轉(zhuǎn)該變化。即姜黃素可使腦損傷后機體抗氧損傷的酶SOD和CAT的活性增加，而脂質(zhì)氧化損傷后的產(chǎn)物MDA的含量減少，GSH的含量增加，該研究結(jié)果與已有研究一致[21]。

Nrf2為含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，機體未受損傷時，常存在于細胞漿中。研究顯示細胞質(zhì)接頭蛋白(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)可與Nrf2的氨基端特異性結(jié)合，抑制Nrf2活性，機體受刺激時，Nrf2經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)移至細胞核，磷酸化的Nrf2可通過ERK、P38等通路與Maf家族蛋白結(jié)合形成二聚物，隨后Nrf2與ARE相結(jié)合，激活下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶的表達，誘導(dǎo)多種抗氧化酶及解毒酶基因的協(xié)同表達，例如iNOS和HO-1，從而發(fā)揮對組織/細胞的保護作用[22-23]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，TBI組、TBI+S組腦組織中Nrf2的mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.05)，iNOS和HO-1的含量也顯著增加(P<0.05)；與TBI組、TBI+S組相比，姜黃素治療后腦損傷腦組織中Nrf2的mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)，iNOS和HO-1的含量也顯著減少(P<0.05)，即姜黃素可逆轉(zhuǎn)Nrf2、iNOS和iNOS的變化。表明姜黃素能夠下調(diào)Nrf2的mRNA和蛋白表達，通過抑制Nrf2的表達，激活和誘導(dǎo)下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶iNOS和HO-1的表達，發(fā)揮腦損傷的保護作用，實驗結(jié)果與已有研究相一致[24]。

此外，本研究采用采用DMSO作為姜黃素的溶劑。為排除DMSO所產(chǎn)生的影響，特增加溶劑對照組(即文中TBI+S組)。試驗結(jié)果表明，該組的mRNA和蛋白表達水平和TBI組相近(P>0.05)，其它指標(biāo)如腦組織中MDA、GSH、SOD、CAT、HO-1和iNOS含量/活性變化或免疫組化所測得Nrf2表達水平，都和TBI組差別不大。即提示其可能的腦保護功能并未出現(xiàn)。究其原因，是因為一則DMSO的腦保護功能可能相對有限，且和陽性組(即TBI+C組)同樣加入，即使存在有限的腦保護作用，其誤導(dǎo)干擾影響也是均衡的；二則本實驗中最終姜黃素的溶解溶劑并不是純DMSO，其中DMSO的量非常較少，幾乎可以忽略不計。具體為：姜黃素先配置成2 g/mL的母液(溶劑為DMSO)，實驗時用生理鹽水稀釋2000倍成1 mg/mL，其中DMSO的量非常少，體積百分濃度約為1/2000，起不到明顯的腦保護作用。但在今后的研究中，還將進一步關(guān)注此問題。

綜上，姜黃素可促進腦損傷大鼠腦組織的抗氧化應(yīng)激作用，它能夠通過降低Nrf2的表達，激活下游抗氧應(yīng)激相關(guān)的通路，使下游抗氧應(yīng)激相關(guān)的指標(biāo)發(fā)生改變，從而起到對腦組織的保護作用。

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