六年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果分析

邢 進(jìn)，馮育芳，王 洪，張雪清，付 瑞，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

能力驗(yàn)證(proficiency testing, PT)是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來(lái)判定實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力的活動(dòng)。作為一項(xiàng)重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力。參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室證明其技術(shù)能力的一種重要方式，也是認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國(guó)際相互承認(rèn)協(xié)議(MRA)的必要條件之一。尋求中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)認(rèn)可和已獲準(zhǔn)認(rèn)可的機(jī)構(gòu)必須滿足CNAS的能力驗(yàn)證相關(guān)政策，并按照CNAS能力驗(yàn)證領(lǐng)域、頻次要求參加CNAS組織或承認(rèn)的能力驗(yàn)證活動(dòng)，包括能力驗(yàn)證計(jì)劃、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和測(cè)量審核活動(dòng)。[1-2]。

近年來(lái)，我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域不斷發(fā)展，許多相關(guān)研究已達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)作為保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的根本手段，開(kāi)展能力驗(yàn)證活動(dòng)勢(shì)在必行。通過(guò)能力驗(yàn)證活動(dòng)，可以增進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室間的交流，發(fā)現(xiàn)自身不足，補(bǔ)充、完善內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)，提高質(zhì)量檢測(cè)能力和水平。本院從2011年開(kāi)始采用與CNAS聯(lián)合舉辦能力驗(yàn)證活動(dòng)，在病毒[3-5]、病原菌[6-8]和遺傳[9-10]檢測(cè)項(xiàng)目上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。2015年本院順利通過(guò)了CNAS能力驗(yàn)證提供者(Proficiency Testing Provider，PTP)的現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審，成為合格的能力驗(yàn)證提供者。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)的重要內(nèi)容，依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測(cè)方法(2)》[11]，對(duì)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢測(cè)方法主要包含分離培養(yǎng)法和血清學(xué)方法。目標(biāo)菌主要包括感染呼吸道和腸道的病原菌。本院作為能力驗(yàn)證活動(dòng)的提供者，依據(jù)CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》[1]和CNAS-RL03《能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》[12]在2011、2013～2017年共開(kāi)展了六次能力驗(yàn)證活動(dòng)，包括對(duì)7種病原菌的檢測(cè)?，F(xiàn)將其匯總?cè)缦隆?/p>

1 材料和方法

1.1 樣品制備

1.1.1 血清樣品

用標(biāo)準(zhǔn)菌株超聲波破碎制備免疫抗原，免疫小鼠和大鼠，獲得免疫血清。用ELISA和IFA方法分別測(cè)定支原體和泰澤病原體的抗體效價(jià)，制成強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性的工作濃度和陰性樣本后分裝于螺口凍存管，至-20℃保存。

1.1.2 帶菌樣品

將目標(biāo)菌株和干擾菌株復(fù)蘇后分別采用生化鑒定和16SrDNA測(cè)序的方式進(jìn)行鑒定，確認(rèn)無(wú)誤后開(kāi)展下一步制備。用滅菌生理鹽水制成菌懸液，然后按比例加入細(xì)菌保護(hù)液。與滅菌的或帶菌清楚的動(dòng)物樣品均勻混合，制成帶菌勻漿。樣品分裝于螺口1.5 mL無(wú)菌凍存管中。2014年開(kāi)始，樣品均采用冷凍干燥處理。見(jiàn)表1。

六次能力驗(yàn)證中設(shè)置了免疫血清和帶菌樣品。所用菌株和樣品形式如表1。

1.2 樣品檢驗(yàn)

編號(hào)前，依據(jù)CNAS-GL03[13]文件要求，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法對(duì)制備好的樣品進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，確保樣品符合要求。分別隨機(jī)抽取已制備樣品總數(shù)量的10%用于均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)。進(jìn)行均勻性評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)血清樣品采用OD值S≤0.3σ方法，對(duì)帶菌樣品定性觀察培養(yǎng)出的目標(biāo)菌落數(shù)。穩(wěn)定性評(píng)價(jià)至少進(jìn)行4℃、室溫(23℃～25℃)和36℃溫度下的存放穩(wěn)定性檢驗(yàn)，血清樣品時(shí)間至少為2周，帶菌樣品時(shí)間至少為1個(gè)月。

1.3 樣品編號(hào)

除2011年采用相同編號(hào)外，其他年份的比對(duì)樣品均采用順序編號(hào)，各樣品隨機(jī)組合，由軟件自動(dòng)分配，確保每個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)得到3份或5份樣品，見(jiàn)表1。2016年樣品分組采用三種不同樣品全部隨機(jī)的方式編排，因此有可能出現(xiàn)各種組合，即可能存在3份陰性或3份陽(yáng)性的極端情況。實(shí)驗(yàn)室無(wú)法通過(guò)樣品編號(hào)判斷組別，防止了實(shí)驗(yàn)室間對(duì)結(jié)果的相互溝通。

1.4 樣品發(fā)放

2015年之前的樣品通過(guò)EMS形式運(yùn)輸，外包裝為泡沫塑料，內(nèi)至冰袋和樣品。2016年后除個(gè)別地區(qū)的限制，仍采用冰袋冷藏外，其他地區(qū)均采用干冰冷鏈運(yùn)輸。

1.5 評(píng)價(jià)方法

各實(shí)驗(yàn)室收到的所有樣品的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果完全一致時(shí)，被判定為滿意結(jié)果；任何1份樣品的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致時(shí)，即判定為不滿意結(jié)果；實(shí)驗(yàn)室如果未按時(shí)限反饋結(jié)果，也將判定為不滿意結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 參與單位統(tǒng)計(jì)

從2011年、2013～2017年，共有45家單位參與了能力驗(yàn)證活動(dòng)，參與次數(shù)4次以上的有18家，見(jiàn)圖1。參與單位類型主要分為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防控制中心、藥監(jiān)系統(tǒng)、科研院校和企業(yè)實(shí)驗(yàn)室，見(jiàn)圖2。2011年只有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)參與。其中藥檢系統(tǒng)和科研院校的數(shù)量變化相對(duì)較大。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)能力驗(yàn)證所用菌株和樣品形式Tab.1 Strains and sample forms of PT for detection of laboratory animal pathogenic bacteria

圖2 參與單位類型Fig.2 Types of laboratories participating in PT

圖1 單位參與次數(shù)Fig.1 Laboratory participation statistics

2.2 結(jié)果匯總

2011年開(kāi)展了2項(xiàng)比對(duì)項(xiàng)目，檢測(cè)血清中的抗體。2012年未開(kāi)展。2013～2017年為檢測(cè)動(dòng)物樣品中的病原菌。幾項(xiàng)能力驗(yàn)證的滿意率在75%～96.2%之間。見(jiàn)表2。其中獲得不滿意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室后續(xù)均通過(guò)了測(cè)量審核。

能力驗(yàn)證活動(dòng)沒(méi)有規(guī)定檢測(cè)方法，參與單位可根據(jù)自身情況自行選擇。參與單位多數(shù)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行檢測(cè)，少數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用PCR方法直接擴(kuò)增樣品中的特異片段，也可取得滿意結(jié)果。

表2 2011年、2013～2017年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌能力驗(yàn)證項(xiàng)目和結(jié)果Tab.2 Projects and results of PT for detection of laboratory animal pathogenic bacteria from 2011 and 2013-2017

3 討論

3.1 項(xiàng)目的選擇

2011年本院首次嘗試性開(kāi)展國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室比對(duì)工作。充分考慮樣品制備和實(shí)驗(yàn)室比對(duì)的可操作性，在項(xiàng)目選擇上遵循由易到難的原則，首先進(jìn)行的是血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目。支原體和泰澤病原體是清潔級(jí)大、小鼠的必檢項(xiàng)目，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中可采用血清學(xué)方法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室軟硬件要求不高，可以比較方便的購(gòu)買到兩種病原菌的檢測(cè)試劑盒。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，能夠直接考察參與實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌血清學(xué)檢測(cè)方面的基本能力。經(jīng)過(guò)一年的準(zhǔn)備，2013年開(kāi)始連續(xù)開(kāi)展了四年腸道細(xì)菌檢測(cè)項(xiàng)目帶菌樣品的能力驗(yàn)證工作。分別是對(duì)綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和肺炎克雷伯桿菌的檢測(cè)。選擇這四種細(xì)菌主要有三方面原因：①易培養(yǎng)、保存和鑒定。這四種細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)條件的要求相對(duì)較低，而且具有特征性的鑒別要點(diǎn)，樣品制備時(shí)容易獲得穩(wěn)定的樣品，便于后續(xù)比對(duì)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。②陽(yáng)性率高。特別是綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中腸道細(xì)菌陽(yáng)性率最高的兩種病原菌，沙門(mén)氏菌和肺炎克雷伯桿菌次之，均嚴(yán)重影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人員健康。③等級(jí)檢測(cè)需要。沙門(mén)氏菌是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中各級(jí)別動(dòng)物首先要排除的病原菌，另外三種細(xì)菌均為SPF級(jí)嚙齒類和兔中必須要排除的病原菌，通過(guò)對(duì)這幾種常見(jiàn)的腸道病原菌的能力驗(yàn)證，能夠比較全面的考察參加實(shí)驗(yàn)室在腸道病原菌檢測(cè)方面的能力。經(jīng)過(guò)連續(xù)幾年的能力驗(yàn)證活動(dòng)，反饋結(jié)果的滿意率逐漸提高。2017年首次開(kāi)展了呼吸道細(xì)菌的帶菌樣品的驗(yàn)證活動(dòng)，在樣品制備方面也提出了更高的要求。先期開(kāi)展的項(xiàng)目是支氣管鮑特桿菌，作為SPF級(jí)動(dòng)物必檢項(xiàng)目，該菌比其他呼吸道病原菌更易培養(yǎng)和保存，通過(guò)制備工藝的調(diào)整，樣品均穩(wěn)實(shí)驗(yàn)獲得理想結(jié)果，為下一步呼吸道病原菌檢測(cè)項(xiàng)目的擴(kuò)展奠定了基礎(chǔ)。

3.2 樣品制備

目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌能力驗(yàn)證的帶菌樣品中的基質(zhì)，如糞便或回盲內(nèi)容物等均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢測(cè)或滅菌處理，確保無(wú)待檢目標(biāo)菌的存在。同時(shí)，通過(guò)添加保護(hù)劑和冷凍干燥的方法，最大程度的保持樣品中受試菌的穩(wěn)定性，不受外界環(huán)境干擾。并且不斷完善準(zhǔn)確性、均勻性和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)方法，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌PT樣品的質(zhì)量控制程序，確保制備出合格的PT樣品。

3.3 檢測(cè)方法

2011年開(kāi)展的支原體和泰澤病原體項(xiàng)目檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)方法，使用設(shè)備和試劑相對(duì)單一，操作程序成熟。使用新鮮配制的試劑，按照常規(guī)檢測(cè)方法操作均可檢測(cè)準(zhǔn)確。針對(duì)帶菌樣品的檢測(cè)方法一方面可選擇傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，對(duì)可疑菌進(jìn)行生化鑒定；另一方面也可以采用快速的PCR方法，對(duì)樣品直接提取DNA，采用特異性引物擴(kuò)增其中的目的基因。根據(jù)5項(xiàng)帶菌項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果，PCR方法均獲得滿意結(jié)果。對(duì)于非常規(guī)性的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室而言，PCR是非常理想的方法。

3.4 不滿意結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)反饋結(jié)果和報(bào)告的分析，將不滿意結(jié)果的原因總結(jié)為以下幾個(gè)方面：(1)培養(yǎng)時(shí)間不足。比如綠膿桿菌在初代分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)在NAC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至72 h；金黃色葡萄球菌初代在高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)至36～48 h，最有利于菌落形態(tài)的觀察。(2)可疑菌落篩錯(cuò)誤。從樣品的初代分離培養(yǎng)物中篩選出可疑的目標(biāo)菌需要有豐富的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，初代可疑菌的挑取對(duì)后續(xù)的細(xì)菌鑒定至關(guān)重要。綠膿桿菌比對(duì)項(xiàng)目中設(shè)置了不產(chǎn)色素菌株，金黃色葡萄球菌項(xiàng)目中設(shè)置了淺黃色菌落的木糖葡萄球菌作為干擾項(xiàng)，沙門(mén)菌項(xiàng)目中設(shè)置了普通變形桿菌作為干擾項(xiàng)，支氣管鮑特桿菌項(xiàng)目中設(shè)置了嗜肺巴斯德桿菌作為干擾項(xiàng)。當(dāng)出現(xiàn)大量非典型菌落和相似菌落的情況時(shí)有可能出現(xiàn)漏檢。(3)生化鑒定錯(cuò)誤。生化鑒定是細(xì)菌鑒定的關(guān)鍵步驟。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手工鑒定時(shí)容易造成主觀判定的誤差。當(dāng)個(gè)別生化項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)不符時(shí)，容易得出假陰性結(jié)論。(4)報(bào)告書(shū)寫(xiě)錯(cuò)誤。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，原始記錄中編號(hào)書(shū)寫(xiě)混淆導(dǎo)致最終報(bào)告錯(cuò)誤。(5)未及時(shí)反饋結(jié)果。當(dāng)能力驗(yàn)證樣品發(fā)樣時(shí)間有可能與高?；蚩蒲袉挝坏氖罴傧鄾_突，造成未及時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)，造成結(jié)果反饋超期。

最初的從不滿意結(jié)果的原因能夠看出鑒定試劑有可能成為結(jié)果的決定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)試劑主要包括培養(yǎng)基、生化鑒定試劑、血清學(xué)檢測(cè)試劑等。專門(mén)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)的試劑仍然比較匱乏。現(xiàn)有這些試劑的質(zhì)量和判定標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異。2011年的兩項(xiàng)檢測(cè)均為血清學(xué)方法，支原體采用ELISA方法，泰澤病原體采用ELISA或IFA方法。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上支原體和泰澤病原體的抗體檢測(cè)試劑非常少，進(jìn)口試劑往往價(jià)格昂貴，訂購(gòu)周期長(zhǎng)，很大程度上限制了檢測(cè)工作的開(kāi)展。在細(xì)菌培養(yǎng)基方面，國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)量不斷提高，從比對(duì)結(jié)果和原始記錄分析，不同來(lái)源的國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口培養(yǎng)基對(duì)分離結(jié)果的沒(méi)有顯著影響。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測(cè)中，對(duì)可疑菌的生化鑒定是最關(guān)鍵內(nèi)容。隨著檢測(cè)技術(shù)和檢測(cè)條件的提高，自動(dòng)化鑒定設(shè)備已經(jīng)逐步應(yīng)用于檢測(cè)中。2013～2017年使用商品化鑒定試紙條或自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的實(shí)驗(yàn)室所占比例分別為30%左右，均獲得滿意結(jié)果。采用手工生化鑒定時(shí)，常因試劑反應(yīng)弱或反應(yīng)滯后造成主觀判斷錯(cuò)誤。

3.5 工作展望

開(kāi)展能力驗(yàn)證的根本目的是為了提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)的能力和水平。本院開(kāi)展能力驗(yàn)證以來(lái)，參與單位數(shù)量從2011年的8家增加到最多時(shí)的30家，一共有45個(gè)單位參與了能力驗(yàn)證工作。前幾年的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)能力驗(yàn)證滿意率整體穩(wěn)定，并且呈穩(wěn)步升高的趨勢(shì)。隨著國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)水平的不斷提升，能力驗(yàn)證樣品的難度設(shè)置也應(yīng)相應(yīng)增加，同時(shí)對(duì)PTP的要求也更高。雖然順利的完成了此前的能力驗(yàn)證工作，但其中很多環(huán)節(jié)仍有待改進(jìn)，比如完善樣品制備工藝、增加檢測(cè)項(xiàng)目，豐富樣品設(shè)置等。希望在全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作者的共同努力和支持下，能力驗(yàn)證工作能夠助力國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)整體水平的進(jìn)一步提高。

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