殼聚糖協(xié)同生物源保鮮劑對冷鮮牛肉的保鮮效果

李儒仁，林世文，榮良燕，沈 瑞，張 鵬，葉盛德，勵建榮,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州 121013；2.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），天津農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；3.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 臺州 317200）

冷鮮牛肉經(jīng)歷排酸后熟過程，質(zhì)地柔軟有彈性、口感好、味道鮮美，深受消費者青睞。然而冷鮮牛肉在屠宰與運輸過程中受到微生物污染或機械損傷時極易腐敗變質(zhì)[1-2]。因此，延長冷鮮牛肉的保鮮期，并保證其質(zhì)量極為重要。

目前，肉類制品保鮮技術(shù)主要有冷鏈、輻照、氣調(diào)及保鮮劑等[3]。冷鏈系統(tǒng)可以延長冷鮮牛肉的保鮮期，但假單胞菌屬、腸桿菌屬等嗜冷微生物的生長繁殖容易導致冷鮮牛肉腐敗變質(zhì)，并且受限于成本問題，超市中采用的大多數(shù)冷鏈系統(tǒng)（4 ℃）會使牛肉產(chǎn)生一定的汁液流失，因此，冷鏈系統(tǒng)通常與保鮮劑結(jié)合使用，以延長冷鮮牛肉的保鮮期，減少其汁液流失[4-5]。輻照技術(shù)能顯著降低微生物的數(shù)量，延長冷鮮牛肉保鮮期，但經(jīng)過輻照后的冷鮮牛肉會產(chǎn)生不良輻照氣味[6]。與輻照技術(shù)相比，氣調(diào)保鮮更適合保鮮冷鮮牛肉，在延長保鮮期的同時能夠保持牛肉良好的感官品質(zhì)[7]，但因其成本過高尚未實現(xiàn)大規(guī)模推廣[8]。化學防腐劑，如苯甲酸鈉等已被廣泛應用于肉品保鮮，但攝入過量的苯甲酸鈉可能會引起腹瀉、腹痛等癥狀，且苯甲酸鈉會與人體內(nèi)的氫氧自由基結(jié)合生成苯，能夠引發(fā)癌變，對人體健康造成危害[9]。相比于化學防腐劑，生物源保鮮劑具有天然、安全等優(yōu)點[10]。本研究旨在探索生物源保鮮劑與殼聚糖結(jié)合使用在延長冷鮮牛肉保鮮期、降低牛肉汁液流失方面的效果。乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸3 種生物源保鮮劑的抑菌范圍不同，但將其復配使用可以擴大抑菌范圍，協(xié)同改變細胞膜的通透性，進而抑制多種類型致腐微生物的生長繁殖[11-12]。前期實驗[13]發(fā)現(xiàn)，復配生物源保鮮劑處理冷鮮牛肉可以有效延長其保鮮期，但貯藏過程中汁液流失嚴重。殼聚糖是一種天然堿性多糖，無毒性，具有廣譜抑菌作用[14]。殼聚糖易于在細菌表面堆積，形成致密薄膜，阻礙細胞運輸營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制微生物生長，防止冷鮮牛肉腐敗變質(zhì)[15]。殼聚糖具有良好的成膜性能，可以降低冷鮮牛肉在貯藏過程中的汁液流失，但殼聚糖與復配生物源保鮮劑結(jié)合使用能否進一步改善保鮮效果并降低汁液流失目前尚不清楚。本研究將前期實驗篩選出的復配生物源保鮮劑（乳酸鏈球菌素2.5 g/L、ε-聚賴氨酸3.0 g/L、納他霉素1.5 g/L）與殼聚糖結(jié)合用于冷鮮牛肉保鮮，并以菌落總數(shù)、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值及汁液流失率等指標評價其保鮮效果，旨在延長冷鮮牛肉的保鮮期并減少其汁液流失。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉購于錦州市大潤發(fā)超市。

乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε-聚賴氨酸（均為食品級） 浙江新銀象生物工程有限公司；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；輕質(zhì)氧化鎂（分析純） 天津市津北精細化工有限公司；氯化鈉（分析純） 北京華騰天海環(huán)?？萍加邢薰?；殼聚糖（分子質(zhì)量35 kD，脫乙酰度≥90%）、商業(yè)保鮮劑（含肉桂酸鉀、乳酸鏈球菌、VC等） 武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司。

1.2 儀器與設備

B C D-2 1 5 K A L M冰箱 青島海爾股份有限公司；LDZX-50FB滅菌鍋 上海申安電器有限公司；JYL-C012絞肉機 九陽股份有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FJ300-SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠；LRH-150生化恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒醫(yī)療器械有限公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；FE20 pH計 美國Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將超市購買的牛肉置于冰盒中，立即送往實驗室進行處理。刀和砧板經(jīng)75%酒精擦拭消毒，并在紫外燈下照射20 min；無菌條件下分割牛肉，每份60 g，用無菌水沖淋后放入對應保鮮液中浸泡；用無菌濾紙擦去牛肉表面殘留水分，置于蒸煮袋中，用封口機封口并做好標記，置于4 ℃冰箱中保存。所有操作均在無菌環(huán)境下進行，每隔4 d取樣測定其各項指標。

1.3.2 保鮮劑的制備

配制乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度2.5 g/L、納他霉素1.5 g/L、ε-聚賴氨酸3.0 g/L的復合保鮮液；用質(zhì)量分數(shù)為1%的醋酸溶液配制質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL的殼聚糖溶液；配制質(zhì)量分數(shù)為0.8%的商業(yè)保鮮劑（含肉桂酸鉀、乳酸鏈球菌、VC等）溶液。

對照組（CK）：無菌水浸泡10 min；處理組1（T1）：3 種生物源保鮮劑復合溶液浸泡10 min；處理組2（T2）：3 種生物源保鮮劑復合溶液浸泡10 min后取出，放入殼聚糖溶液中浸泡10 min；處理組3（T3）：商業(yè)保鮮劑浸泡10 min。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 菌落總數(shù)

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[16]，采用固體培養(yǎng)基方法測定菌落總數(shù)。菌落總數(shù)參考標準[17]：一級鮮度為小于4.0 （lg（CFU/g）），二級鮮度為4.0～6.0 （lg（CFU/g）），變質(zhì)肉大于6.0 （lg（CFU/g））。

1.3.3.2 TVB-N值

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[18]。取10 g絞碎肉樣于蒸餾管，加入1 g氧化鎂粉末，全自動凱氏定氮儀測定。TVB-N值參考標準：一級鮮度為小于15 mgN/100 g，二級鮮度為15～20 mgN/100 g，變質(zhì)肉大于20 mgN/100 g[19]。

1.3.3.3 肉色

使用色差計測定牛肉表面的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）[20]。

1.3.3.4 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[21]。取5 g絞碎肉樣于燒杯中，加入45 mL蒸餾水，均質(zhì)，過濾，取濾液用pH計測定。參考標準：一級鮮度的pH值為5.8～6.2，二級鮮度為6.3～6.6，pH值大于6.7則為變質(zhì)肉[22]。

1.3.3.5 汁液流失率

參照Davis等[23]的方法。將肉樣瀝干水分后的質(zhì)量記錄為m1，用濾紙將肉樣表面水分吸干后的質(zhì)量記錄為m2。汁液流失率按照下式計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個指標均重復測定3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析LSD法與雙變量相關性分析法分析數(shù)據(jù)間的相關性與顯著性（p＜0.05）；采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮牛肉貯藏期間的菌落總數(shù)變化

圖1 冷鮮牛肉貯藏期間的菌落總數(shù)變化Fig. 1 Change in total viable counts of chilled beef during storage

菌落總數(shù)是反映冷鮮肉新鮮度的重要指標之一。由圖1可知，在貯藏過程中，冷鮮牛肉的菌落總數(shù)整體呈上升趨勢。貯藏4 d時，CK組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)為5.92 （lg（CFU/g）），T1組為5.53 （lg（CFU/g）），均屬于二級鮮肉；T2、T3組分別為3.18、3.71 （lg（CFU/g）），屬于一級鮮肉。貯藏16 d時，CK、T1、T3組冷鮮牛肉均為變質(zhì)肉，而T2組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)為4.75（lg（CFU/g）），屬于二級鮮肉。與CK組相比，T2組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)下降了4 個數(shù)量級，保鮮效果顯著（p＜0.05）。可見，復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜能顯著降低貯藏期間冷鮮牛肉的菌落總數(shù)。

2.2 冷鮮牛肉貯藏期間的TVB-N值變化

圖2 冷鮮牛肉貯藏期間的TVB-N值變化Fig. 2 Change in TVB-N value of chilled beef during storage

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，各組冷鮮牛肉的TVB-N值均呈上升趨勢，這是由于貯藏期間酶和細菌將牛肉中的蛋白質(zhì)分解為胺類及含氮化合物。貯藏8 d時，CK組冷鮮牛肉的TVB-N值大于20 mgN/100 g，屬于變質(zhì)肉；各處理組冷鮮牛肉貯藏期間的TVB-N值始終低于對照組，TVB-N值增長的抑制效果較好；與CK組相比，T2組冷鮮牛肉的保鮮效果顯著（p＜0.05）；貯藏16 d時，CK、T1和T3組冷鮮牛肉均屬于變質(zhì)肉，而T2組冷鮮牛肉的TVB-N值為16.9 mgN/100 g，屬于二級鮮肉，可見，復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜的保鮮效果優(yōu)于單獨使用殼聚糖溶液[24]。

2.3 冷鮮牛肉貯藏期間的色差值變化

表1 各處理組冷鮮牛肉貯藏期間的L*、a*和b*變化Table 1 Changes in color parameters of chilled beef during storage

由表1可知，隨著貯藏時間的延長，T1組冷鮮牛肉的L*逐漸降低，T2、T3組呈先升高后降低的趨勢。貯藏8 d期間，各處理組冷鮮牛肉的L*均大于對照組，原因可能是肉樣在浸漬過程中吸收了更多的溶液，從而增加了肉樣表面光的反射；貯藏4～12 d期間，各組冷鮮牛肉的L*均無顯著差異（P＞0.05）。貯藏8～12 d期間，T2組冷鮮牛肉的L*大于其他各組；貯藏16 d時，T3組冷鮮牛肉的L*顯著降低（p＜0.05）。

各組冷鮮牛肉的a*隨著貯藏時間的延長而呈降低趨勢，但各組間差異均不顯著（P＞0.05）。貯藏4～12 d期間，T2、T3組冷鮮牛肉的a*均低于對照組。各組冷鮮牛肉的b*呈現(xiàn)與a*相同的變化趨勢，且T2組處理對冷鮮牛肉b*的影響較明顯。貯藏8～16 d期間，T2組冷鮮牛肉的b*大于CK組與T1組?？梢?，殼聚糖涂膜處理對冷鮮牛肉的L*與b*有一定的改善作用，但是降低了牛肉的a*。

2.4 冷鮮牛肉貯藏期間的pH值變化

圖3 冷鮮牛肉貯藏期間的pH值變化Fig. 3 Change in pH value of chilled beef during storage

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，各組冷鮮牛肉的pH值整體均呈增加趨勢，這是由于酶和細菌將蛋白質(zhì)分解為胺類及含氮化合物等堿性物質(zhì)。貯藏16 d時，T2組冷鮮牛肉的pH值為6.56，屬于二級鮮肉，而其他組冷鮮牛肉的pH值均已超過6.70，屬于變質(zhì)肉，且T2組與CK組差異顯著（p＜0.05），這說明生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖對細菌的增長有抑制作用，延緩了細菌對蛋白質(zhì)的降解，有效保持了冷鮮牛肉的品質(zhì)。

2.5 冷鮮牛肉貯藏期間的汁液流失率變化

圖4 冷鮮牛肉貯藏期間的汁液流失率變化Fig. 4 Change in percentage drip loss of chilled beef during storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，各組冷鮮牛肉的汁液流失率均呈上升趨勢。貯藏4～12 d期間，T2組冷鮮牛肉的汁液流失率與其他3 組均有顯著差異（p＜0.05），可見T2組處理改善了冷鮮牛肉的汁液流失。貯藏8 d時，T2組冷鮮牛肉的汁液流失率為6.24%，較CK組降低了2.13%，較T1組降低了2.11%。T2組冷鮮牛肉的汁液流失率低于其他各組的原因是殼聚糖具有良好的成膜性，可以在冷鮮牛肉表面形成致密的薄膜，阻礙汁液流出[25]。牛肉的菌落總數(shù)與汁液流失率呈正相關（r＝0.788），細菌生長繁殖對牛肉的結(jié)構(gòu)組織造成影響，導致牛肉有較大的汁液流失。殼聚糖與復配生物源保鮮劑協(xié)同發(fā)揮作用，破壞細菌的膜結(jié)構(gòu)，使其代謝發(fā)生紊亂，從而抑制細菌的生長繁殖，顯著降低牛肉的汁液流失率[26-27]。

3 討 論

復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖對冷鮮牛肉的保鮮效果優(yōu)于單獨使用復配生物源保鮮劑或商業(yè)保鮮劑，可以延長冷鮮牛肉的保鮮期至16 d。冷鮮肉的腐敗變質(zhì)是由內(nèi)源性酶和致腐微生物的共同作用導致的，其中致腐微生物的大量繁殖對冷鮮肉的影響較大[28]，因此抑制致腐微生物的生長繁殖是延長冷鮮牛肉保鮮期的關鍵。本研究中，用復配生物源保鮮劑處理的冷鮮牛肉貯藏8 d時的菌落總數(shù)較對照組降低了2 個數(shù)量級，而用復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜處理的冷鮮牛肉貯藏8 d時的菌落總數(shù)較對照組降低了4 個數(shù)量級。由此可見，復配生物源保鮮劑不能有效抑制冷鮮牛肉中致腐微生物的生長，大部分致腐微生物經(jīng)一段時間的鈍化后會再度繁殖。另外，殼聚糖與復配生物源保鮮劑具有協(xié)同效應，可以使冷鮮牛肉具有更長的保鮮期。其主要原因可能在于復配生物源保鮮劑改變了致腐微生物的細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞膜的通透性增大，殼聚糖分子進入致腐微生物體內(nèi)，攜帶正電荷的氨基基團與致腐微生物細胞核中帶有負電荷的DNA、RNA結(jié)合，造成致腐微生物生理代謝紊亂而死亡[29-30]。同時，通過殼聚糖涂膜載體的作用能夠使復配生物源保鮮劑緩慢釋放到牛肉表面，充分發(fā)揮作用，這與張希斌等[31]的研究結(jié)果一致。

揮發(fā)性鹽基氮是酶和細菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的堿性揮發(fā)物質(zhì)。隨著貯藏時間的延長，細菌數(shù)量增多，堿性揮發(fā)物質(zhì)逐漸積累，使冷鮮牛肉的TVB-N值與pH值增大。貯藏16 d時，對照組、商業(yè)保鮮劑組、復配生物源保鮮劑組冷鮮牛肉均屬于變質(zhì)肉，而復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜保鮮組冷鮮牛肉的TVB-N值為16.9 mgN/100 g，屬于二級鮮肉。貯藏過程中，復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖處理冷鮮牛肉的汁液流失率較對照組降低了2.13%，較復配生物源保鮮劑組降低了2.11%，這一結(jié)果優(yōu)于殼聚糖與葡萄糖美拉德反應產(chǎn)物對冷鮮肉汁液流失的控制[32]。復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)始終保持在較低水平，貯藏16 d時仍屬于二級鮮肉，優(yōu)于海藻酸鈉對冷鮮牛肉的保鮮效果[33]。但在貯藏后期，復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜處理冷鮮牛肉的汁液流失率較對照組僅降低1.13%，這可能是由于隨著冷鮮牛肉貯藏時間的延長，牛肉的持水性下降，水分流出破壞了保鮮劑在牛肉表面的膜結(jié)構(gòu)[34]。貯藏后期汁液流失嚴重將不利于冷鮮牛肉的保鮮，若能與氣調(diào)包裝相結(jié)合，可能會取得更好的效果。因此，在后續(xù)研究中有必要繼續(xù)探索。

4 結(jié) 論

復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜保鮮可以有效延長冷鮮牛肉的保鮮期至16 d，且貯藏前期，冷鮮牛肉的汁液流失率較對照組降低了2.13%；貯藏16 d時，復配生物源保鮮劑結(jié)合殼聚糖涂膜處理組冷鮮牛肉的菌落總數(shù)為4.75 （lg（CFU/g）），屬于二級鮮肉，菌落總數(shù)較對照組降低了4 個數(shù)量級，較復配生物源保鮮劑組降低了3 個數(shù)量級。上述結(jié)果表明，復配生物源保鮮劑與殼聚糖之間存在協(xié)同效應，這為進一步開發(fā)利用生物源保鮮劑提供了依據(jù)。

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