衍生化LC-MS／MS法測(cè)定大鼠血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽的含量

徐鵬遙，楊 漾，蘇夢(mèng)翔*，狄 斌**

（中國(guó)藥科大學(xué) 1江蘇省藥物分子設(shè)計(jì)與成藥性優(yōu)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2蛋白質(zhì)化學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3藥物分析系，南京210009）

谷胱甘肽（glutatione）［1］是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合且含有巰基的三肽，具有抗氧化及整合解毒的作用。谷胱甘肽不僅作為內(nèi)源性物質(zhì)參與生命活動(dòng)，在臨床上也有著廣泛應(yīng)用。主要用于治療重金屬、氟化物等中毒以及輔助治療肝炎、溶血性疾病、白內(nèi)障等疾病，其含量水平與機(jī)體健康息息相關(guān)［2］。

谷胱甘肽體內(nèi)分析最大的難點(diǎn)在于它的不穩(wěn)定性，其在血漿中能迅速轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，增加了樣品的測(cè)定難度。血漿中谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽的比值是反映機(jī)體氧化損傷的重要指標(biāo)，從20世紀(jì)50年代起，研究者就開(kāi)始建立谷胱甘肽的各種測(cè)定方法。目前主要包括熒光光譜法、HPLC法、HPCE法及質(zhì)譜法等［3－7］，其中LC-MS／MS法是現(xiàn)今最常用的測(cè)定谷胱甘肽的方法。在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中［8－10］，對(duì)谷胱甘肽進(jìn)行直接測(cè)定的定量限多在50～200 nmol／L之間，靈敏度和選擇性都不能滿足生物體內(nèi)樣本分析的要求。對(duì)谷胱甘肽進(jìn)行衍生化能夠有效保護(hù)半胱氨酸中的殘基，避免谷胱甘肽被氧化，使得測(cè)定值更加接近實(shí)際值。目前利用衍生化法測(cè)定谷胱甘肽的定量限多集中在1～100 nmol／L之間［11－13］。但現(xiàn)有的衍生化法存在靈敏度低、前處理復(fù)雜、重復(fù)性差等問(wèn)題。隨著對(duì)谷胱甘肽研究的不斷深入，如何解決干擾、快速并準(zhǔn)確的測(cè)定復(fù)雜樣品中谷胱甘肽的含量成了研究熱點(diǎn)之一。

本研究將新型季銨衍生化試劑4-（N-馬來(lái)酰亞胺）苯基三甲基碘化銨（MPTA）應(yīng)用于谷胱甘肽在大鼠血漿中的測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。極大地提高了對(duì)谷胱甘肽測(cè)定的靈敏度，最終定量下限可達(dá)到10 pmol／L左右。目前尚未有文獻(xiàn)對(duì)大鼠血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽的測(cè)定進(jìn)行報(bào)道。少量文獻(xiàn)對(duì)測(cè)定人體血漿中谷胱甘肽的含量進(jìn)行了報(bào)道［14－16］，由于谷胱甘肽的不穩(wěn)定性及分析方法的不同，使得這些研究的測(cè)定結(jié)果存在著很大差異。此外，在內(nèi)源性谷胱甘肽的測(cè)定中，大量含巰基的內(nèi)源性蛋白會(huì)對(duì)樣品的衍生化產(chǎn)生較大的干擾，也會(huì)使測(cè)定結(jié)果存在差異。因此本方法對(duì)生物體內(nèi)谷胱甘肽準(zhǔn)確的定量、定性分析，以及其存在狀態(tài)的正確評(píng)價(jià)有著重要的臨床意義。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

乙腈（色譜純，美國(guó)默克公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)天地公司）；MPTA（自制，純度大于98%）；甘氨酰酪氨酸內(nèi)標(biāo)（上海阿拉丁生化科技有限公司，純度大于98%），L-還原型谷胱甘肽（GSH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度大于98%）水淡超純水。

1.2 儀 器

Shimadzu 2010高效液相色譜儀（日本島津公司），含在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱；Thermo TSQ質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司），含電噴霧離子源ESI、Xcalibur數(shù)據(jù)工作站；BS 21 S十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；XHF-1高速分散器（上海金達(dá)生化儀器廠）；PL5242純化水制備系統(tǒng)（美國(guó)頗爾公司）；D3415R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)BioTool公司）。

1.3 動(dòng) 物

雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重（200±20）g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax HILIC PLUS色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5μm）；預(yù)柱：菲羅門(mén) C4（4.0 mm×2.0 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水（含 0.1%甲酸）（75∶25）；流速：1 mL／min；柱溫：35℃。內(nèi)標(biāo)：甘氨酰酪氨酸。

2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：ESI；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；離子極性：正離子；檢測(cè)：谷胱甘肽原型監(jiān)測(cè)離子為m／z308.06→179.00（M＋H）＋，碰撞電壓為25 eV。谷胱甘肽衍生化產(chǎn)物監(jiān)測(cè)離子為m／z538.20→265.02（M＋H）＋，碰撞電壓為35 eV。內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)離子為m／z239.14→91.05［M＋H］＋，碰撞電壓為40 eV。

質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓4 000 eV；毛細(xì)管溫度350℃；鞘氣壓力30 psi（1 psi＝6 894.8 Pa）；反吹氣壓力1 psi；套管透鏡補(bǔ)償電壓67 V；源內(nèi)碰撞解析電壓8 V。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

2.3.1 谷胱甘肽儲(chǔ)備液的配制 精密稱取樣品約10 mg，置 100 mL量瓶中，用稀釋液（乙腈-水-甲酸，50∶50∶0.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含谷胱甘肽0.1 mg的溶液作為母液，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取甘氨酰酪氨酸約10 mg，置10 mL量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每 1 mL中約含1.0 mg的溶液，作為母液，以稀釋液稀釋制成質(zhì)量濃度為50μg／mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 衍生化試劑溶液的配制 精密稱取MPTA約10 mg，置10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含1.0 mg的溶液，作為衍生化試劑，最終稀釋成0.1 mg／mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3.4 谷胱甘肽-MPTA儲(chǔ)備液配制 將上述的谷胱甘肽儲(chǔ)備液與0.1 mg／mL的衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入過(guò)量的半胱氨酸與衍生化試劑反應(yīng)。按照反應(yīng)充分進(jìn)行計(jì)算得到每1 mL中含谷胱甘肽衍生物0.1 mg的溶液作為母液。－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 前處理方法

2.4.1 方法學(xué)樣品前處理 精密吸取血漿樣品50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各5μL，加入乙腈100μL，旋渦 1 min后，4℃，12 000 r／min離心10 min，取上清液直接進(jìn)樣，取上清液10μL進(jìn)樣分析，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算血漿樣品中谷胱甘肽的濃度。2.4.2 血漿樣品前處理 精密吸取血漿樣品50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液 5μL，加入衍生化試劑（0.1 mg／mL）100μL，20℃旋渦40min后4℃，12 000 r／min離心10 min，取上清液直接進(jìn)樣，取上清液10μL進(jìn)樣分析，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算血漿樣品中谷胱甘肽的濃度。

3 結(jié) 果

3.1 方法專屬性

在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，谷胱甘肽衍生物的出峰時(shí)間在2.85 min，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間在1.58 min，峰形良好，基線平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)考察了大鼠空白血漿及方法學(xué)低濃度點(diǎn)樣品色譜圖，結(jié)果表明方法特異性好，樣品和內(nèi)標(biāo)測(cè)定不受干擾，專屬性結(jié)果見(jiàn)圖1。

Figure 1 Representative SRM chromatogramsof a blank plasma sample（A）；a blank plasma sample（B）；a blank plasma sample spiked with the internal standard（IS）（C）；and a blank plasma sample spiked with glutathione（GSH）at the limit of quantitation（3.000 ng／mL）（D）

3.2 線性范圍

精密吸取相關(guān)儲(chǔ)備液，配成模擬血漿質(zhì)量濃度為 3.000，10.00，30.00，100.0，300.0，1 000，2 000 ng／mL的血漿樣品。按照“2.4”項(xiàng)下方法學(xué)樣品處理方法同法處理，取10μL進(jìn)樣分析，分別記錄谷胱甘肽衍生物的色譜峰面積（As）及內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積（Ai）。以谷胱甘肽衍生化產(chǎn)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（As／Ai）為橫坐標(biāo)，以GSH的質(zhì)量濃度c（ng／mL）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性權(quán)重回歸（權(quán)重系數(shù)為1／c2）：3.000～2 000 ng／mL。在不同天處理5條標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別為：y＝0.004 8x＋0.136 4；y＝0.008 0x－0.590 2；y＝0.004 4x＋0.266 7；y＝0.002 7x＋0.248 7；y＝0.005 5x－0.082 3。

血漿5條標(biāo)準(zhǔn)曲線平均比值回歸方程為c＝183×－0.323 4，相關(guān)系數(shù)r為 0.997 1。按上述方法血漿中谷胱甘肽的線性范圍為3.000～2 000 ng／mL，定量下限（LLOQ）定為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)，即3.000 ng／mL。

3.3 準(zhǔn)確度

精密吸取血漿樣品50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA溶液5μL，渦旋 30 s，制成含 10.00，100.0，1 000 ng／mL，谷胱甘肽-MPTA低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品。精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5μL，加入乙腈100μL，旋渦1 min后4℃，12 000 r／min離心10 min，取上清液直接進(jìn)樣，取上清液10μL進(jìn)樣分析，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算血漿樣品中谷胱甘肽的濃度。連續(xù)測(cè)定5次，考察方法準(zhǔn)確性。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確度在85%～115%之間，RSD在4.56%～13.91%之間。

3.4 提取回收率

樣品的制備：取空白血漿50μL置1.5 mL樣品管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，渦旋30 s混勻，分別制成含10.00，100.0和1 000 ng／mL，谷胱甘肽-MPTA的低、中、高3個(gè)濃度的樣品，每種濃度各5份，按照“2.4”項(xiàng)下方法學(xué)樣品處理方法同法處理，取10μL進(jìn)樣分析。

對(duì)照品的制備：取空白血漿50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，加入100μL的乙腈，渦旋30 s，12 000 r／min，離心 5 min。于上清液中加入內(nèi)標(biāo)5μL以及谷胱甘肽-MPTA標(biāo)準(zhǔn)溶液5μL，配制成濃度點(diǎn)為 10.00，100.0，1 000 ng／mL的樣品，渦旋1 min，12 000 r／min離心 5 min，取上清液作為對(duì)照低、中、高3個(gè)濃度各5份。

分別取上述溶液各10μL進(jìn)樣。按As／Asr×100%計(jì)算樣品提取回收率，其中As為樣品溶液中谷胱甘肽衍生物的峰面積，Asr為對(duì)照溶液中谷胱甘肽衍生物的峰面積。按Ai／Air×100%計(jì)算內(nèi)標(biāo)提取回收率，其中Ai為樣品溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積，Air分對(duì)照溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積。結(jié)果表明低、中、高3種質(zhì)量濃度的提取回收率均大于50%且穩(wěn)定。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

3.5.1 基質(zhì)樣品的制備 取空白血漿50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，加入乙腈100μL，渦旋30 s，12 000 r／min，離心5 min。于上清液中加入內(nèi)標(biāo)5μL以及GSH-MPTA標(biāo)準(zhǔn)溶液5μL，配制成質(zhì)量濃度為 10.00，100.0，1 000 ng／mL的樣品，渦旋1 min，12 000 r／min離心 5 min，取上清液進(jìn)樣，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度各5份。

3.5.2 對(duì)照樣品的制備 于1.5 mL離心管中分別精密加入含GSH-MPTA 100.0，1 000和10 000 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各5μL，加入PBS緩沖液50μL，渦旋30 s，制得低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度各做5份，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高質(zhì)量濃度測(cè)得基質(zhì)效應(yīng)的比值分別為114.79%、107.54%和 105.93%，RSD分別為11.54%、7.89%和5.85%。上述結(jié)果表明谷胱甘肽在本實(shí)驗(yàn)條件下不受基質(zhì)效應(yīng)的影響，符合生物樣本測(cè)定的要求。

3.6 穩(wěn)定性考察

制備中濃度（100.0 ng／mL）的樣品 1份，按“2.4”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法同法處理，立即取上清液10μL進(jìn)樣，作為0 h的樣品溶液；將剩余的樣品溶液于4℃進(jìn)樣器樣品盤(pán)中放置24 h后，取10μL進(jìn)樣。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的濃度，與0 h的相應(yīng)濃度比較。由測(cè)定結(jié)果可知處理后的谷胱甘肽-MPTA進(jìn)樣溶液放置于4℃的樣品盤(pán)上，12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，但24 h后樣品降解較為嚴(yán)重。

3.7 方法應(yīng)用

將上述建立的方法對(duì)實(shí)際大鼠空白血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽進(jìn)行檢測(cè)。選取6批大鼠空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法同法處理后，取10μL進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 Determination of endogenous glutathione（GSH）in rat′s plasma

4 討 論

4.1 衍生化試劑的選擇

在內(nèi)源性谷胱甘肽的測(cè)定中，血漿中大量的含巰基內(nèi)源性蛋白會(huì)對(duì)樣品的衍生化產(chǎn)生較大的干擾。為避免這一干擾，本研究選用MPTA作為衍生化試劑。內(nèi)源性蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大，立體位阻大，難以在同樣條件下與MPTA反應(yīng)。谷胱甘肽的離子化效率較低以及基質(zhì)抑制都使得樣品的質(zhì)譜響應(yīng)較低，MPTA在谷胱甘肽衍生化產(chǎn)物中同時(shí)引入了季銨基團(tuán)和烷基鏈。季銨基團(tuán)自身帶一個(gè)正電荷，在質(zhì)譜中響應(yīng)很高；烷基鏈能夠增加疏水性，以此增加衍生化產(chǎn)物的離子化效率。因此極大提高了本方法對(duì)谷胱甘肽測(cè)定的靈敏度，最終定量下限可達(dá)到10 pmol／L左右。此外，衍生化試劑MPTA所含的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與谷胱甘肽中的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，該反應(yīng)十分迅速，條件溫和，并且能夠避免半胱氨酸中的殘基與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)生產(chǎn)二硫鍵，從而提高了樣品穩(wěn)定性，成功解決了目前衍生化法存在的操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、重復(fù)性差等問(wèn)題。衍生化試劑結(jié)構(gòu)及反應(yīng)如圖2所示。

Figure 2 Derivatization of GSH with 4-（N-maleimido）phenyl trimethylammonium iodide（MPTA）

4.2 谷胱甘肽衍生化條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，考察溫度、反應(yīng)時(shí)間及衍生化試劑的濃度對(duì)反應(yīng)的影響。每個(gè)條件下平行配制6份樣品，根據(jù)峰面積及峰面積的RSD選擇最優(yōu)的反應(yīng)條件。谷胱甘肽選擇質(zhì)量濃度為300.0 ng／mL。由表2可知，衍生化試劑濃度越大對(duì)谷胱甘肽的影響較大，隨著質(zhì)量濃度增加，其峰面積反而越來(lái)越小，推測(cè)由于衍生化試劑與多肽樣品之間存在離子抑制。在反應(yīng)時(shí)間為40 min，衍生化溫度為30℃的實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)峰面積大小及RSD的比較，選擇0.1 mg／mL的衍生化試劑濃度。反應(yīng)時(shí)間對(duì)峰面積的影響不是太大，但是對(duì)峰面積的穩(wěn)定性影響比較大，在反應(yīng)溫度40℃，衍生化試劑質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL，結(jié)合峰面積大小及峰面積的RSD選擇反應(yīng)時(shí)間為40 min。反應(yīng)溫度結(jié)果顯示，在40 min、衍生化試劑質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL反應(yīng)溫度為20℃的反應(yīng)條件下，其峰面積最穩(wěn)定。因此，最終確定的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20℃，反應(yīng)時(shí)間40 min，衍生化試劑的質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL。

Table 2 Effect of various factors on GSH derivatization

Effect factors Level Peak areas RSD／%c（MPTA）0.1 mg／mL 115 022 10.75 0.5 mg／mL 178 397 12.61 1.0 mg／mL 118 265 11.44 1.5 mg／mL 153 133 11.05 t R 10 min 124 891 34.74 20 min 105 890 27.97 30 min 119 437 41.53 40 min 131 658 11.47 Reaction temperature 10℃ 202 540 40.90 20℃ 238 615 13.76 30℃ 193 329 28.88 40℃ 6 512 48.29

4.3 色譜條件的選擇

由于巰基的存在，使得谷胱甘肽具有很強(qiáng)的極性和水溶性。在以往液相色譜檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)程中，較常采用的是反相C18色譜柱，但這種色譜柱對(duì)強(qiáng)極性的化合物保留很弱。因此，本實(shí)驗(yàn)選用保留有機(jī)不同的親水作用色譜（HILIC）體系。該體系采用高比例的有機(jī)相及少量的水相組成二元流動(dòng)相，在極性的固定相上進(jìn)行洗脫分析，高揮發(fā)有機(jī)相具有較低的離子抑制尤其適宜與電噴霧（ESI）聯(lián)用，提高了質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度［17］。同時(shí)，高比例有機(jī)相具有低黏度和高滲透性的特點(diǎn)，與相似柱粒徑和流速的RPLC相比，色譜柱壓大大降低，因此可以獲得較高的色譜柱效和對(duì)稱的峰型，從而實(shí)現(xiàn)快速分析。流動(dòng)相為乙腈-水（含0.1%甲酸）（75∶25）時(shí)，谷胱甘肽在Zorbax HILIC PLUS色譜柱上保留時(shí)間合適，色譜峰形良好并且能與內(nèi)標(biāo)物有效分離。

4.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

谷胱甘肽與MPTA衍生化后，產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為537，其在正離子模式下容易產(chǎn)生（M＋H）＋峰，根據(jù)流動(dòng)注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定其正負(fù)離子模式及單／多電荷峰。谷胱甘肽產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為537，其母離子為MSm／z538.20，兼顧離子響應(yīng)靈敏度高與穩(wěn)定性好兩個(gè)方面選擇監(jiān)測(cè)子離子為MSm／z265.02，碰撞電壓為35 eV。選擇甘氨酰酪氨酸作為內(nèi)標(biāo)，其母離子同樣為單電荷，兼顧離子響應(yīng)靈敏度與穩(wěn)定性，選擇內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)為MSm／z239.14→91.05，碰撞電壓為40 eV。谷胱甘肽原型相對(duì)分子質(zhì)量為307，其母離子為 MSm／z308.06，兼顧離子響應(yīng)靈敏度高與穩(wěn)定性好兩個(gè)方面選擇監(jiān)測(cè)子離子為MSm／z179.00，碰撞電壓為25 eV。質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓4 000 eV；毛細(xì)管溫度350℃；鞘氣壓力30 psi；反吹氣壓力1 psi；套管透鏡補(bǔ)償電壓67 V；源內(nèi)碰撞解析電壓8 V。

5 小 結(jié)

本研究建立了衍生化LC-MS／MS測(cè)定血漿中的內(nèi)源性谷胱甘肽的方法，在3.000～2 000 ng／mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.99；定量下限的精密度和準(zhǔn)確度均符合要求；低濃度樣品的準(zhǔn)確度在80%～120%之間，中，高濃度的準(zhǔn)確度在85%～115%之間；處理后的進(jìn)樣溶液放置于4℃的樣品盤(pán)上，在12 h內(nèi)的穩(wěn)定。最終測(cè)得大鼠血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽質(zhì)量濃度在10 ng／mL左右?？紤]到谷胱甘肽為血漿中內(nèi)源性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中先對(duì)谷胱甘肽對(duì)照溶液進(jìn)行衍生化處理，并將多余的MPTA與半胱氨酸反應(yīng)，之后加入空白基質(zhì)中進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，其中內(nèi)源性的半胱氨酸并不會(huì)干擾測(cè)定。本研究建立的衍生化方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)血漿中谷胱甘肽進(jìn)行測(cè)定，并且能夠增加多肽的質(zhì)譜響應(yīng)，提高方法靈敏度。同時(shí)，具有前處理操作簡(jiǎn)單、使用試劑種類(lèi)較少、反應(yīng)效率高等優(yōu)點(diǎn)。

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