肉豆蔻-8散提取物對過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

張媛彥，肖云峰，李文妍，王玉華*

（1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特010110；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，呼和浩特010110；3內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，呼和浩特010110）

肉豆蔻-8散是由沉香、肉豆蔻、丁香、廣棗、木香、旋覆花、阿魏和牦牛心八味藥材組成，該方最早收錄于《普濟方集》中［1］。目前該方劑被《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》第二冊收錄［2］。該方具有鎮(zhèn)“赫依”、止痛、溫胃、祛“巴達干”、燥“協(xié)日烏素”的功效，臨床用于各種“赫依”病、心“赫依”熱、心煩、氣短、失眠、心供血不足、心區(qū)疼痛、風(fēng)濕性心臟病等。目前，本課題組對于肉豆蔻-8散的研究主要包括有效成分的含量測定、動物實驗?zāi)Ｐ偷乃幮W(xué)研究和藥代動力學(xué)分析等［3－6］。課題組還對肉豆蔻-8散提取物的主要成分進行指認(rèn)和定量分析，其有效成分包括丁香酚、鞣花酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和去氫二異丁香酚等。肖云峰等［7］運用整體動物試驗及測定內(nèi)源性物質(zhì)含量的方法，已從體內(nèi)評價了該方劑對實驗動物心臟的保護作用。

乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)是一種可以排除體液、神經(jīng)等干擾因素并保持心肌結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的體外實驗研究模型。高效、穩(wěn)定的培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞有助于從細(xì)胞層面探討心血管疾病的發(fā)病機制及其治療手段［8］。H2O2作為高活性反應(yīng)分子性氧簇（ROS）之一，極易通過細(xì)胞膜，它可以通過Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生OH-，從而導(dǎo)致膜脂過氧化、DNA鏈斷裂和蛋白質(zhì)的損傷［9］。H2O2易獲得、性質(zhì)穩(wěn)定且應(yīng)用方便，常被用做體外氧化應(yīng)激損傷模型建立的工具［10］。因此，本實驗采用體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞的方法，利用H2O2模擬體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，首次從細(xì)胞層面進一步研究肉豆蔻-8散提取物對心肌的保護作用，以綜合評價肉豆蔻-8散的臨床應(yīng)用價值及其可能的作用機制。

1 材 料

1.1 肉豆蔻-8散提取物的制備

稱取肉豆蔻-8散10.0 g于500 mL圓底燒瓶中，加入75%乙醇250 mL，加熱回流2次，每次30 min，合并濾液，蒸干得浸膏約3 g。取肉豆蔻-8散提取物約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入DMSO 100μL使其完全溶解，用無血清培養(yǎng)液稀釋至刻度，配成1 mg／mL肉豆蔻-8散提取物原液。用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存，使用時稀釋成相應(yīng)濃度。

1.2 試 劑

肉豆蔻-8散（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院制備）；DMEM／F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰蛋白酶（中國Biotopped公司）；Ⅱ型膠原酶（德國Sigma公司）；30%過氧化氫（天津永晟精細(xì)化工有限公司）；DMSO（中國Coolaber公司）；MTT（美國 Amresco公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；lactate dehydrogenase（LDH）、creatine kinase（CK）、aspartate aminotransferase（AST）（寧波美康生物科技股份有限公司）；Superoxide dismutase（SOD）、malonydialdehyde（MDA）、NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細(xì)胞凋亡試劑盒（美國BD公司）。

1.3 儀 器

超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；倒置式生物顯微鏡（德國Leica公司）；酶標(biāo)儀（日本Bio-rad公司）；全自動生化分析儀（愛爾蘭Sapphire公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.4 動 物

清潔級，Wistar乳鼠，1～3 d齡，體重（6.66±2.00）g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（蒙）2014-0001。

2 方 法

2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

實驗操作在無菌條件下進行。取1～3 d齡Wistar乳鼠，浸泡75%酒精消毒。用眼科剪沿劍突正中線略偏左側(cè)剪取心臟心尖部，置預(yù)冷的PBS緩沖溶液中清洗3遍，將其轉(zhuǎn)移入0.1%胰酶中，均勻剪成約1 mm3的碎塊，棄上清液。加入0.1%胰酶6 mL吹打管吹打，37℃水浴消化6 min，不斷振搖，自然沉降后，棄上清液。再加入0.08%胰酶與0.05%Ⅱ型膠原酶的混合酶5 mL于37℃水浴消化5 min，中間振搖3 min，吸取上清液，用等體積預(yù)冷含10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)消化10次。細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾至離心管中，1 000 r／min，離心 10 min。用含 20%FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)1 h，以差速貼壁的方法去除已貼壁的成纖維細(xì)胞。吸出細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為0.1 mmol／L的5-溴脫氧尿嘧啶40μL，以抑制成纖維細(xì)胞的生長，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后換液。取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞用于實驗。

2.2 分組及給藥

實驗共分為5組：正常對照組、模型組、肉豆蔻-8散（高、中、低）劑量組。正常對照組加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，作用12 h后換液，繼續(xù)用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h；模型組加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，作用12 h后換液，加入終濃度為100μmol／L H2O2的無血清培養(yǎng)液，作用2 h；肉豆蔻-8散低、中、高劑量組分別加入終濃度為25、50、100μg／mL含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液，作用12 h后換液，再加入終濃度為100μmol／L H2O2的無血清培養(yǎng)液，作用2 h。

2.3 MTT法檢測心肌細(xì)胞活力

2.3.1 H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的建立 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度每毫升3×105個，在96板上每孔接種100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液。正常對照組每孔加入無血清培養(yǎng)液100μL；模型組每孔加入H2O2終濃度分別為25、50、100、200、400μmol／L無血清培養(yǎng)液 100μL。在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，每孔加入 MTT溶液（0.5 mg／mL）20μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 150μL，振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm處讀取吸收度，計算細(xì)胞抑制率。

2.3.2 肉豆蔻-8散提取物對正常心肌細(xì)胞的影響取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升3×105個，在96板上每孔接種100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液。正常對照組每孔加入無血清培養(yǎng)液100μL；給藥組每孔加入含肉豆蔻-8散提取物終濃度分別為 25、50、100μg／mL的無血清培養(yǎng)液100μL。在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，采用MTT法檢測心肌細(xì)胞活力。

2.3.3 肉豆蔻-8散提取物對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升3×105個，在96板上每孔接種100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作，孵育2 h結(jié)束后，于倒置顯微鏡下觀察各孔中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率為各組吸收度和正常組吸收度的比值。

2.4 生化指標(biāo)檢測

2.4.1 培養(yǎng)液中LDH、CK、AST含量的檢測 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升6×105個，在6板上每孔接種2 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作，孵育2 h結(jié)束后，分別收集各孔培養(yǎng)液。1 000 r／min，離心7 min，吸取上清液至離心管中，每組平行處理6份。采用全自動生化分析儀對處理好的樣本進行檢測，檢測指標(biāo)包括LDH、CK和AST。

2.4.2 細(xì)胞中MDA、SOD、NO含量的檢測 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升6×105個，在6板上每孔接種2 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作，孵育2 h結(jié)束后，棄去每孔培養(yǎng)液，每孔加入PBS緩沖液2 mL，用細(xì)胞刮刀收集各組細(xì)胞并重懸，1 000 r／min，5 min，棄上清液。用 RIPA裂解液于冰臺上裂解細(xì)胞，進行BCA定量，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書測定細(xì)胞中MDA、SOD、NO的含量。

2.5 肉豆蔻-8散提取物對H2 O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷凋亡的影響

2.5.1 Hoechst染色觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài) 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)細(xì)胞密度為每毫升2×105個，在24孔板上每孔接種0.5 mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作，孵育2 h結(jié)束后，棄去每孔培養(yǎng)液。每孔加入Hoechst 33342染液250μL，避光孵育30 min，棄去染液，PBS緩沖液清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)。

2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率 取培養(yǎng)3 d同步搏動的心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個，在6板上每孔接種2 mL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液。實驗分組及給藥按照“2.2”項下操作，孵育2 h結(jié)束后，分別收集各孔培養(yǎng)液。1 000 r／min，離心5 min，棄去上清液。用0.25%胰酶消化不同組別孔底的心肌細(xì)胞。消化過程終止后，1 000 r／min，離心5 min，棄去上清液。合并以上兩次所得細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗2次，棄去PBS緩沖液，加入1×結(jié)合緩沖液100μL重懸細(xì)胞，按照AnnexinV／PI凋亡檢測試劑盒操作說明，1 h內(nèi)完成檢測。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型的建立

與正常對照組比較，不同濃度的H2O2組均有極顯著性差異（P＜0.01）。隨H2O2劑量增大，心肌細(xì)胞損傷率增加且呈濃度依賴性。其中，加入100μmol／L H2O2抑制率達到50%左右，符合實驗要求。因此，選擇100μmol／L H2O2作為實驗損傷模型。結(jié)果見圖1。

Figure 1 H2 O2-induced cardiomyocyte injurymodel**P＜0.01 vs control group

3.2 肉豆蔻-8散提取物對正常心肌細(xì)胞的影響

與正常對照組比較，各給藥組對心肌細(xì)胞活力無明顯影響（P＞0.05）。這表明肉豆蔻-8散提取物對正常心肌細(xì)胞沒有影響，不會干擾后續(xù)肉豆蔻-8散提取物對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷影響的實驗結(jié)果。結(jié)果見圖2。

Figure2 Effectof Roudoukou-8 San on normal cardiomyocytes（ˉx±s，n＝6）

3.3 肉豆蔻-8散提取物對H2 O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

如圖3所示，與正常對照組比較，模型組吸收度顯著降低，細(xì)胞存活率顯著下降，說明模型組心肌細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01）。25、50、100 μg／mL肉豆蔻-8散各劑量組與模型組相比，其細(xì)胞存活率均有所提高，且具有極顯著性差異（P＜0.01）。肉豆蔻-8散低劑量組與高劑量組之間具有極顯著性差異（P＜0.01），中劑量組與高劑量組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。說明肉豆蔻-8散提取物能明顯提高H2O2損傷心肌細(xì)胞的活力，且作用呈劑量依賴性，以高劑量組保護作用最佳。

3.4 肉豆蔻-8散提取物對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)影響

于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，分組處理前，各組心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好。不同實驗組經(jīng)藥物干預(yù)之后，正常組呈單層簇狀生長，且偽足多而飽滿，搏動明顯，節(jié)律一致；H2O2模型組出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞數(shù)減少、細(xì)胞胞漿空泡、偽足少、細(xì)胞脫落、懸浮、溶解壞死等明顯損傷現(xiàn)象；肉豆蔻-8散各劑量組與H2O2模型組比較，心肌細(xì)胞形態(tài)不同程度好轉(zhuǎn)，且以高劑量（100μg／mL）組改善效果最明顯。結(jié)果見圖4。

Figure 3 Effects of Roudoukou-8 San on H2 O2-induced cardiomyocyte injury（ˉx±s，n＝6）**P＜0.01 vs Control；＃＃P＜0.01 vs Modol；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Roudoukou-8 San（100μg／mL）

3.5 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK和AST的含量

與正常對照組比較，模型組上清液中LDH、CK和AST釋放量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，肉豆蔻-8散低劑量組（25μg／mL）、中劑量組（50μg／mL）、高劑量組（100μg／mL）上清液中LDH、CK和AST含量明顯下降（P＜0.01），且隨著給藥組濃度增加呈劑量依賴性。結(jié)果見表1。

3.6 心肌細(xì)胞中MDA、SOD、NO的含量

與正常對照組相比，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯降低（P＜0.01），MDA和NO含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，肉豆蔻-8散低劑量組（25μg／mL）心肌細(xì)胞內(nèi) SOD活力上升（P＜0.05），中劑量組（50μg／mL）和高劑量組（100μg／mL）心肌細(xì)胞內(nèi) SOD活力明顯上升（P＜0.01）；各劑量肉豆蔻-8散給藥組均可明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)MOD和NO水平（P＜0.01），且隨著給藥組濃度增加呈劑量依賴性。結(jié)果見表2。

3.7 Hoechst染色觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)

Hoechst熒光細(xì)胞核染色結(jié)果顯示，正常對照組心肌細(xì)胞成均一的核染，且未見異常核，見圖5-A；模型組細(xì)胞呈典型凋亡狀態(tài)，鏡下可見染色質(zhì)濃集、核固縮、核碎裂、細(xì)胞數(shù)量少等多種凋亡形態(tài)學(xué)特征，見圖5-B；肉豆蔻-8散低、中、高劑量組可見核固縮、破裂等現(xiàn)象明顯減小、細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，其細(xì)胞形態(tài)分別見圖5-C、5-D、5-E。

3.8 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率

結(jié)果顯示，正常對照組只有少部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，見圖6-A；模型組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，見圖6-B；而肉豆蔻-8散各劑量組與模型組相比，細(xì)胞的凋亡情況明顯減少，但并不可以恢復(fù)至正常水平，見圖6-C、6-D、6-E。

對流式細(xì)胞圖導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算心肌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見表3。

Table 1 Content of LDH，CK and AST in the culture solution of cardiomyocytes

Table 1 Content of LDH，CK and AST in the culture solution of cardiomyocytes

**P＜0.01 vs control grop；＃＃P＜0.01 vs model groupLDH：Lactate dehydrogenase；CK：Creatine kinase；AST：Aspartate aminotransferase

Group LDH（U／L） CK（U／L） AST（U／L）Control 20.18±4.93 5.38±1.14 2.10±0.42 Model 73.97±8.80** 12.13±1.26** 11.18±0.74**Roudoukou-8 San（25μg／mL） 53.55±5.22＃＃ 9.8±0.73＃＃ 7.90±0.69＃＃Roudoukou-8 San（50μg／mL） 46.13±4.88＃＃ 8.58±0.66＃＃ 6.13±0.54＃＃Roudoukou-8 San（100μg／mL） 27.15±5.13＃＃ 7.30±0.64＃＃ 4.03±0.46＃＃

Table 2 Contents of MDA，SOD，and NO in myocardial cells

Table 2 Contents of MDA，SOD，and NO in myocardial cells

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control grop；＃＃P＜0.01 vs model group MDA：Malonydialdehyde；SOD：Superoxide dismutase；NO：Nitric oxide

Group MDA／（nmol／mg prot） SOD／（U／mg Hb） NO／（μmol／L）Control 0.65±0.12 67.92±8.51 6.24±1.49 Model 2.82±0.30** 35.38±5.79** 36.25±3.30**Roudoukou-8 San（25μg／mL） 1.99±0.16＃＃ 43.03±4.79* 27.13±4.28＃＃Roudoukou-8 San（50μg／mL） 1.56±0.25＃＃ 50.30±5.14＃＃ 16.02±3.36＃＃Roudoukou-8 San（100μg／mL） 0.95±0.12＃＃ 59.84±6.41＃＃ 10.10±2.13＃＃

Figure 5 Hoechst staining to observe the apoptoticmorphology of cardiomyocytesA：Control；B：Model；C：Roudoukou-8 San（25μg／mL）；D：Roudoukou-8 San（50μg／mL）；E：Roudoukou-8 San（100μg／mL）

Figure 6 Flow cytometry detection ofmyocardial cell apoptosis rateA：Control；B：Model；C：Roudoukou-8 San（25μg／mL）；D：Roudoukou-8 San（50μg／mL）；E：Roudoukou-8 San（100μg／mL）

Table 3 Apoptosis rate of cardiomyocytes detected by flow cytometry

Table 3 Apoptosis rate of cardiomyocytes detected by flow cytometry

**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs model grop

Group Apoptosis rate／%Control 3.68±0.69 Model 51.19±2.02**Roudoukou-8 San（25μg／mL） 35.90±2.14＃＃Roudoukou-8 San（50μg／mL） 29.20±1.88＃＃Roudoukou-8 San（100μg／mL） 15.82±1.81＃＃

結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組有極顯著性差異（P＜0.01），H2O2模型組細(xì)胞凋亡率顯著增加；與模型組比較，肉豆蔻-8散各劑量組均有極顯著性差異（P＜0.01），肉豆蔻-8散各劑量組心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，表明肉豆蔻-8散提取物可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨肉豆蔻-8散劑量的增加逐漸降低。

4 討 論

本研究對原代乳鼠心肌細(xì)胞進行分離和培養(yǎng)，利用100μmol／L H2O2建立體外心肌氧化損傷模型。MTT檢測結(jié)果顯示，H2O2能夠使細(xì)胞活力顯著減低，肉豆蔻-8散提取物可以增加H2O2損傷心肌細(xì)胞的活力。通過倒置光學(xué)顯微鏡和Hoechst染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肉豆蔻-8散提取物能夠顯著改善H2O2誘導(dǎo)狀態(tài)下心肌細(xì)胞形態(tài)、增高其存活率并降低其凋亡率。

心肌酶活性變化是判斷心肌損傷的重要標(biāo)志。目前臨床上多以血清中LDH、CK、AST活性升高作為心肌缺血的早期診斷指標(biāo)，LDH還可以作為衡量細(xì)胞壞死的指標(biāo)［11－12］。正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞中心肌酶LDH、CK和AST活性非常低，而當(dāng)心肌細(xì)胞膜受損后，心肌酶將迅速大量釋放，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH、CK和AST含量明顯增高［13］。實驗結(jié)果顯示，用H2O2干預(yù)的肉豆蔻-8散不同劑量組均能夠顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK和AST活性且呈劑量依賴性，表明肉豆蔻-8散提取物能夠抑制損傷心肌細(xì)胞LDH、CK和AST的漏出，維護細(xì)胞膜的完整性，起到保護心肌細(xì)胞的作用。

不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜主要成分之一，在氧自由基的攻擊下極易發(fā)生脂質(zhì)過氧化而生成MDA。MDA的含量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，能夠間接反映出心肌細(xì)胞損傷的程度［14］；SOD是生物體內(nèi)清除自由基的重要酶類之一，是評估機體抗氧化防御體系功能的重要指標(biāo)。SOD可對抗或阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞，具有特殊的生理活性［15］；NO是一種新型的生物信息遞質(zhì)，NO的含量過高會對心肌細(xì)胞產(chǎn)生強烈的毒性損傷［16－17］。實驗結(jié)果表明，肉豆蔻-8散各劑量組細(xì)胞內(nèi)MDA含量較模型組明顯降低，SOD活力明顯比模型組增高；經(jīng)H2O2損傷后，心肌細(xì)胞內(nèi)NO含量明顯升高，造成線粒體酶活性被抑制。肉豆蔻-8散提取物可明顯降低損傷后心肌細(xì)胞內(nèi)NO含量。

本實驗通過流式細(xì)胞儀AnnexinV／PI染色，測定細(xì)胞凋亡率。實驗結(jié)果顯示，肉豆蔻-8散提取物可明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡，對H2O2損傷的心肌細(xì)胞凋亡有明顯保護作用。

本研究認(rèn)為肉豆蔻-8散提取物對心肌細(xì)胞具有顯著抗過氧化損傷保護作用，可以抑制細(xì)胞凋亡，提示肉豆蔻-8散可能成為良好的防治心血管疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，有望為心血管疾病的治療發(fā)揮重要作用。

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