絲切蛋白1表達(dá)水平與原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性

趙 瀛， 張春燕， 郭奕超， 戴 謙， 王蓓麗*， 郭 瑋， 潘柏申，2

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，廈門 361015

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，約占肝癌的80%，惡性程度高，患者生存率較低[1]。2016年的全球數(shù)據(jù)表明，肝癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第4位，死亡率位居第2位[2]。目前HCC最有效的治療手段仍然是手術(shù)。但HCC患者早期癥狀不典型，確診時一般處于中晚期，基本喪失了手術(shù)機會或手術(shù)預(yù)后不佳。因此，尋找有效的早期診斷及預(yù)后判斷生物標(biāo)志物是HCC臨床診治的關(guān)鍵。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因，在腫瘤早期就已存在，與腫瘤的基因編碼改變有關(guān)[3]，且在病變極早期就可通過血行轉(zhuǎn)移[4]，與腫瘤細(xì)胞動力密切相關(guān)。絲切蛋白1(cofilin 1)是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，能調(diào)控細(xì)胞偽足的形成過程，是調(diào)控細(xì)胞動力的重要環(huán)節(jié)，與胃癌[5]、前列腺癌[6]和乳腺癌[7]等多種腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。我們的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)HCC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)與HCC組織細(xì)胞中cofilin 1蛋白表達(dá)存在顯著差異，提示cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC預(yù)后相關(guān)。因此，本研究進(jìn)一步探討HCC組織cofilin 1蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，為HCC的臨床診治提供新的研究靶標(biāo)，改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年12月至2014年5月確診為HCC，并于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)的126例患者作為研究對象。其中，男性101例，女性25例；年齡(54±11)歲，>50歲73例、小于或等于50歲53例，患者人口學(xué)特征及基線資料詳見表1。根據(jù)所選病例手術(shù)切除標(biāo)本病理號將其相應(yīng)的石蠟包埋標(biāo)本取出，挑選組織完整清晰的部分。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 HCC組織切片在二甲苯脫蠟、乙醇水化后，置于抗原修復(fù)液(50×EDTA 抗原修復(fù)液，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)中微波修復(fù)9 min，3%過氧化氫溶液中浸泡15 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS漂洗3次，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min，加入小鼠抗人cofilin 1單克隆抗體(一抗，OriGene Technologies)，4℃孵育過夜。PBS代替一抗，作為空白對照。次日PBS 漂洗3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(二抗，工作液體積稀釋比例為1∶5 000，OriGene Technologies)，室溫孵育60 min。DAB顯色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)顯色8 min，蘇木精對比染色20 s，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠固封。

表1 兩組患者人口學(xué)特征及基線資料比較 n， N=126

AFP：甲胎蛋白；BCLC分期：巴塞羅那臨床肝癌分組方案

1.3 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用Pannoramic Viewer軟件對細(xì)胞染色結(jié)果進(jìn)行檢測和半定量評分。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，判斷為cofilin 1陽性細(xì)胞。根據(jù)染色強度(強，3分；中，2分；弱，1分；無，0分)和陽性細(xì)胞百分率(4分，>80%；3分，51%～80%；2分，11%～50%；1分，≤10%；0分，無陽性細(xì)胞)的乘積計算總評分[8](圖1)?？偡?分及以上列為cofilin 1高表達(dá)組，未達(dá)8分則為cofilin 1低表達(dá)組。

圖1 免疫組織化學(xué)染色評分標(biāo)準(zhǔn)(DAB染色)

A: 0分； B: 1分； C: 2分； D: 3分. Original magnification: ×160(基礎(chǔ)圖片), ×1 100(放大部分)

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0和GraphPad prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Spearman相關(guān)分析法分析cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。采用生存分析法繪制無病生存(disease-free survival，DFS)與總生存(overall survival，OS)曲線圖，探討cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)或生存相關(guān)性。采用Cox回歸風(fēng)險比例模型分析影響HCC患者在腫瘤切除術(shù)后生存與早期復(fù)發(fā)的獨立危險因素，計算風(fēng)險比(hazard ratio, HR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織cofilin 1蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖2)表明：HCC組織cofilin 1高表達(dá)組35例；cofilin 1蛋白低表達(dá)組91例。

2.2 Cofilin 1蛋白表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的Spearman相關(guān)性 結(jié)果(表2)表明：cofilin 1蛋白表達(dá)評分與患者術(shù)前甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)水平、腫瘤大小及巴塞羅那臨床肝癌分組方案(BCLC分期)正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而cofilin 1蛋白表達(dá)評分與術(shù)后AFP水平、術(shù)前術(shù)后γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, γ-GT)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、腫瘤包膜完整性和肝硬化及血管侵犯等臨床指標(biāo)無明顯相關(guān)性。

圖2 免疫組織化學(xué)染色測定肝癌組織cofilin 1蛋白的表達(dá)(DAB染色)

A: 肝癌組織cofilin 1蛋白高表達(dá)； B:肝癌組織cofilin 1蛋白低表達(dá). Original magnification: ×160(基礎(chǔ)圖片), ×1 100(放大部分)

表2 Cofilin 1蛋白表達(dá)評分與HCC患者臨床參數(shù)的Spearman相關(guān)性分析 N=126

AFP：甲胎蛋白；γ-GT：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；BCLC分期：巴塞羅那臨床肝癌分組方案

2.3 Cofilin 1蛋白表達(dá)水平與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性 結(jié)果(圖3)表明：cofilin 1高表達(dá)患者術(shù)后DFS明顯短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 1)。臨床亞組分析結(jié)果表明：BCLC分期0/A期亞組(P=0.000 4)和腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.000 1)中cofilin 1高表達(dá)患者術(shù)后DFS明顯短于低表達(dá)患者；而AFP<20 ng/mL亞組(P=0.050 0)和未侵襲亞組(P=0.179 3)中cofilin 1高低表達(dá)患者術(shù)后DFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A：全組(P=0.000 1)； B： BCLC分期0/A期亞組(P=0.000 4)； C：腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.000 1)；D：AFP<20 ng/mL亞組(P=0.05)； E：未侵襲亞組(P=0.179 3)

2.4 Cofilin 1蛋白表達(dá)水平與HCC患者生存情況的相關(guān)性 結(jié)果(圖4)表明：Cofilin 1蛋白低表達(dá)組HCC患者術(shù)后OS明顯長于高表達(dá)組患者(P=0.004 1)；臨床亞組分析結(jié)果表明：BCLC分期0/A期亞組(P=0.001 3)和腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.006 0)cofilin 1蛋白低表達(dá)組HCC患者術(shù)后OS時間明顯長于高表達(dá)組患者(P=0.006 0)，而在AFP<20 ng/mL亞組(P=0.324 8)和未侵襲亞組(P=0.075 5)中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)與生存的危險因素分析 Cox回歸風(fēng)險比例模型單因素分析(表3)發(fā)現(xiàn)：cofilin 1蛋白表達(dá)高低對患者術(shù)后復(fù)發(fā)有預(yù)測價值(P=0.025)，肝硬化、腫瘤直徑大于5 cm、微血管侵犯和CTC高是預(yù)后不良的復(fù)發(fā)因素(P<0.05)；cofilin 1蛋白表達(dá)高低對患者術(shù)后生存也有預(yù)測價值(P=0.004)，腫瘤直徑>5 cm及BCLC分期為B/C是影響術(shù)后生存的顯著因素(P<0.05)。

多因素分析結(jié)果(表3)顯示：cofilin 1蛋白高表達(dá)(HR=1.647，95%CI 1.015～2.672)、肝硬化(HR=2.044, 95%CI 1.133～3.688)、腫瘤直徑大于5 cm(HR=1.989，95%CI 1.235～3.203)和高CTC(HR=1.795，95%CI 1.015～3.173)是導(dǎo)致HCC患者肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素；而cofilin 1蛋白高表達(dá)(HR=2.412，95%CI 1.696～4.940)和腫瘤直徑>5 cm(HR=2.461，95%CI 1.367～4.429)是術(shù)后生存的獨立危險因素。

圖 4 Cofilin 1蛋白表達(dá)水平與各組HCC患者術(shù)后生存情況的相關(guān)性

A：全組(P=0.004 1)； B： BCLC分期0/A期亞組(P=0.001 3)； C：腫瘤直徑<5 cm亞組(P=0.006 0)； D： AFP<20 ng/mL亞組(P=0.324 8)； E：未侵襲亞組(P=0.075 5)

3 討 論

CTC作為腫瘤原發(fā)灶播散的“種子”，在腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[9]。本課題組預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，CTC可作為HCC診斷及預(yù)后的標(biāo)志物；通過對CTC高與CTC低的兩組HCC患者原發(fā)灶的表達(dá)譜芯片進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)兩組HCC患者cofilin 1表達(dá)差異顯著，提示cofilin 1可能是導(dǎo)致CTC釋放入外周血的關(guān)鍵分子，具有重大的研究價值及意義。因此，本研究旨在驗證cofilin 1在HCC根治術(shù)后療效監(jiān)測和預(yù)后評估中的價值。

本研究入組了2012年12月至2014年5月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受肝癌切除術(shù)的HCC患者126例，對患者術(shù)后的組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cofilin 1表達(dá)與患者術(shù)前AFP、腫瘤大小及BCLC分期相關(guān)。進(jìn)一步利用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)：cofilin 1是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后危險因素；在一些低危亞組，如BCLC分期0/A期亞組和腫瘤<5 cm亞組中，cofilin 1高低表達(dá)的HCC患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)的差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究證實cofilin 1是良好的預(yù)后標(biāo)志物，且在臨床上對患者預(yù)后進(jìn)行評估時，比BCLC分期及腫瘤大小更靈敏。

表3 HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)與生存的單因素及多因素風(fēng)險分析

HR：風(fēng)險比(hazard ratio)；95%CI：95%可信區(qū)間；AFP：甲胎蛋白；ALT：谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase)；HBsAg：乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen)；BCLC分期：巴塞羅那臨床肝癌分組方案;TTR：復(fù)發(fā)時間(time to recurrence)；OS：總生存時間(overall survival)

Cofilin 1主要通過腫瘤轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞動力增強、細(xì)胞分裂和細(xì)胞轉(zhuǎn)化啟動對腫瘤細(xì)胞起到調(diào)控作用[10]。Wiskott Aldrich綜合征蛋白家族、肌動蛋白相關(guān)2/3復(fù)合體和肌動蛋白單體主導(dǎo)著突觸形成的過程[11]，而cofilin 1對肌動蛋白單體起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，提示cofilin 1是使腫瘤細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動狀態(tài)的重要因素。

綜上所述，在肝癌臨床診治中，cofilin 1可作為一個用來有效篩選具有較高復(fù)發(fā)風(fēng)險患者的潛在指標(biāo)，從而輔助臨床采取相應(yīng)措施，實施不同的治療策略，制訂個體化的醫(yī)療方案，實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。在后續(xù)的研究中，本課題組會針對cofilin 1的上游調(diào)控因子及相應(yīng)通路進(jìn)行深入探索，并且進(jìn)一步探討cofilin 1與細(xì)胞運動相關(guān)的分子機制。

[ 1 ] FERLAY J, SHIN H R, BRAY F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.

[ 2 ] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1):7-30.

[ 3 ] WANG W, EDDY R, CONDEELIS J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis[J].Nat Rev Cancer, 2007,7(6):429-440.

[ 4 ] JOYCE J A, POLLARD J W.Microenvironmental regulation of metastasis[J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9(4):239-252.

[ 5 ] WANG H, TAO L, JIN F, et al. Cofilin 1 induces the epithelial-mesenchymal transition of gastric cancer cells by promoting cytoskeletal rearrangement[J].Oncotarget,2017,8(24):39131-39142.

[ 6 ] LU L I, FU N I, LUO X U, et al. Overexpression of cofilin 1 in prostate cancer and the corresponding clinical implications[J].Oncol Lett,2015,9(6):2757-2761.

[ 7 ] MAIMAITI Y, LIU Z, TAN J, et al. Dephosphorylated cofilin expression is associated with poor prognosis in cases of human breast cancer: a tissue microarray analysis[J].Onco Targets Ther,2016,9:6461-6466.

[ 8 ] SCHARL A, VIERBUCHEN M, CONRADT B, et al. Immunohistochemical detection of progesterone receptor in formalin-fixed and paraffin-embedded breast cancer tissue using a monoclonal antibody[J].Arch Gynecol Obstet,1990,247(2):63-71.

[ 9 ] VON FELDEN J, SCHULZE K, KRECH T, et al. Circulating tumor cells as liquid biomarker for high HCC recurrence risk after curative liver resection[J].Oncotarget,2017,8(52):89978-89987.

[10] SHISHKIN S, EREMINA L, PASHINTSEVA N, et al. Cofilin-1 and other ADF/Cofilin superfamily members in human malignant cells[J].Int J Mol Sci,2016,18(1). pii: E10.

[11] YANG C, SVITKINA T. Filopodia initiation: focus on the Arp2/3 complex and formins[J]. Cell Adh Migr, 2011, 5(5):402-408.