脊髓背角細胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化參與調(diào)控2,4-二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠慢性癢

吳品雯， 張 浩， 方 浩,3*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院閔行分院麻醉科，上海 201199 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，上海 200032 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海 200032

近年來癢覺分子機制研究取得巨大進展。其中，特異性表達于脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)的Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(Mas-related G protein coupled receptors，Mrgprs)家族蛋白被認為是調(diào)節(jié)癢覺的特異性亞群[1-4]。白細胞介素-31(interleukin-31，IL-31)及其受體參與初級神經(jīng)元癢覺的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。脊髓背根神經(jīng)節(jié)Toll樣受體TRL7、TRL3和TRL4亞型表達能夠增強瘙癢感覺[6-8]。神經(jīng)肽類的利鈉肽前體B(natriuretic peptide precursor b，NPPB)在DRG能夠表達瞬時感受器受體V1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)陽性神經(jīng)元，特異性調(diào)節(jié)癢覺行為；NPPB突變小鼠對癢覺行為反應(yīng)選擇性消失，而痛覺沒有發(fā)生變化[6-8]。此外，神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)解物(如P物質(zhì)和谷氨酸)在初級感覺神經(jīng)元中參與癢覺形成。

本課題組預(yù)實驗結(jié)果表明，小鼠脊髓背角的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路參與了組胺及2,4-二硝基氟苯(2,4- dinitrofluorobenzene，DNFB)誘導(dǎo)的癢覺，提示ERK磷酸化可能參與脊髓背角慢性癢相關(guān)的信號調(diào)節(jié)。因此，本研究以ICR(Institute of Cancer Research)小鼠為研究對象，采用過敏性皮炎模型探討脊髓背角ERK磷酸化與慢性癢信號調(diào)節(jié)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 DNFB(配制成溶液以丙酮為溶劑)、絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)抑制劑U0126購自美國Sigma-Aldich公司。水合氯醛、異丙醇和75%乙醇溶液購自中國醫(yī)藥集團總公司。兔抗鼠磷酸化ERK(pERK)抗體、兔PKC-R抗體、鼠抗GFAP抗體、鼠NeuN抗體和鼠Iba1抗體，以及生物素化羊抗兔二抗和親和素Cy3購自美國Millipore公司。TaKaRa試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 動物分組及模型制備

1.2.1 動物來源及飼養(yǎng) 小鼠為ICR品系，來源于上海市實驗動物資源中心(西普爾-必凱公司)，200只，雄性，8～12周齡。小鼠每5只1籠裝，自由飲水和攝食，嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～25℃，相對濕度為70%，12 h光暗交替照明(7:00～19:00)。

1.2.2 慢性癢模型的建立 面頰部慢性癢模型：每次涂抹DNFB溶液前1 d備皮，選取小鼠右側(cè)頰部，棉棒蘸取DNFB溶液，涂抹于右側(cè)面頰。頸背部慢性癢模型：每次涂抹DNFB前1 d備皮，涂抹后立即放入籠盒中，開始錄像30 min，并記錄30 min內(nèi)小鼠的搔抓行為及搔抓行為的潛伏期，最后統(tǒng)計30 min內(nèi)搔抓的總數(shù)。5 min為1個單位，小鼠后肢抬起搔抓頸部皮膚至后肢撤回至地面記為1次搔抓行為。錄像及搔抓行為計數(shù)均采用雙盲法。

1.3 癢覺行為學(xué)觀察 小鼠隨機分為2組：實驗組涂抹DNFB/丙酮溶液4次制備瘙癢模型，對照組涂抹丙酮溶液。4次涂抹完成(第1、4、11、18天)后，先觀察最后1次涂抹后1、6、12、24 h共4個時間點的小鼠搔抓行為，并在4次涂抹DNFB或丙酮后分別在第1、3、7、14天觀察小鼠是否有自發(fā)性搔抓行為。DNFB實驗組小鼠分為2組：鞘內(nèi)注射U0126組和鞘內(nèi)注射PBS對照組，同樣記錄小鼠搔抓行為次數(shù)及搔抓潛伏期，均采用雙盲法。鞘內(nèi)注射U0126或PBS時，動作要輕盈、準確、迅速。首先要準確定位小鼠腰部髂脊(小鼠背部最突出處)，注射器的針頭與脊髓約成45°夾角，進針及注藥時小鼠尾巴抬動，說明注射效果良好。鞘內(nèi)注射后，分別在第1、3、7、14天觀察小鼠搔抓行為。

1.4 免疫熒光組織化學(xué)染色

1.4.1 脊髓切片的獲取 10%水合氯醛按10 μL/g的劑量進行小鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后迅速用眼科剪剖開小鼠胸部，暴露小鼠心臟，眼科剪去除右心耳，將注射器針頭插入左心室(最佳注射點為心尖處，進針不宜過深，以防穿破左心室造成灌注液進入肺部)，快速推注0.01 mol/L PBS 20 mL，至清涼液體流出。推注過程中，肺部及肝臟逐漸變?yōu)榘咨螅徛谱?%多聚甲醛溶液20 mL；推注過程中出現(xiàn)四肢抽動、僵硬、胡須直立，說明多聚甲醛已進入小鼠大腦，待抽動停止及全身組織變硬后開始取材，仔細完好地分離出頸部脊髓。取材成功后，4%多聚甲醛溶液固定24 h，30%蔗糖脫水24 h，當組織沉底說明脫水效果好，濾紙吸去組織殘余蔗糖，OCT膠包埋組織，放置-20℃。待組織完全凍結(jié)后，用刀將組織從模具中取出，固定于底座上，冰凍切片機進行頸部脊髓切片，脊髓切片厚度為30 μm，采用漂浮切片法保存。

1.4.2 單標染色 采用流動清水沖洗80孔免疫組織化學(xué)板，然后將其晾干。用抗體稀釋液稀釋抗體，加入兔抗鼠pERK一抗(按1∶500 稀釋)，室溫下孵育1 h，置于4℃冰箱過夜。將所有脊髓組織切片從組化板中取出，0.01 mol/L PBS漂洗5 min 3次。加入生物素化的馬抗兔二抗(1∶500 稀釋)，避光及室溫下孵育2 h。PBS漂洗5 min 3次，加入親和素Cy3(1∶500 稀釋)，室溫孵育1 h。PBS漂洗7 min 3次，挑出組織切片，拖拽至玻片，75%甘油封固，4℃保存。熒光顯微鏡觀察組織形態(tài)學(xué)并拍片保存。

1.4.3 雙標染色 基本操作同單標方法，差別在于：一抗為兔抗鼠pERK(1∶500 稀釋)和鼠抗GFAP(1∶1 000 稀釋)，或兔抗鼠pERK(1∶500 稀釋)和鼠抗NeuN(1∶1 000 稀釋)，或兔抗鼠pERK(1∶500 稀釋)和鼠抗Iba1(1∶1 000 稀釋)；二抗為生物素化的羊抗兔bio-HAR和DAM-488(1∶500 稀釋)；三抗為親和素Cy3(1∶500 稀釋)。各步驟間用0.01 mol/L PBS漂洗10 min 3次。

1.5 酪酰胺信號放大(TSA)技術(shù)染色 第1天：漂白液(3% H2O22 mL、甲醇16 mL、PBS 2 mL)漂白脊髓切片10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；TNT漂洗3次，每次5 min；TNB封閉液封閉1 h；加入兔抗鼠pERK抗體(稀釋比例1∶10 000)，將脊髓切片挑回組化板內(nèi)，并置于4℃冰箱過夜。第2天：TNT漂洗3次，每次5 min；加入用TNB稀釋的兔抗性辣根過氧化物酶(稀釋比例為1∶100)，室溫孵育2 h；TNT漂洗3次，每次5 min；加入TSA染色劑(1∶50稀釋)，孵育約20 min，具體以組織染色程度為準，隨時觀察，染色效果好即可終止染色；PBS漂洗3次，每次5 min；pERK染色完成后，加入兔抗鼠Iba1抗體(稀釋比例1∶1 000)，4℃冰箱過夜。第3天：PBS漂洗3次，每次5 min；加入二抗DAR-488(稀釋比例1∶500)，室溫孵育2 h；PBS漂洗3次，每次5 min。

2 結(jié) 果

2.1 DNFB對小鼠行為學(xué)的影響 結(jié)果(圖1)表明：在面頰部模型中，DNFB組和丙酮對照組小鼠涂抹藥物30 min內(nèi)的擦涂行為次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.879)，而丙酮對照組小鼠搔抓行為次數(shù)少于DNFB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)，提示DNFB誘發(fā)的小鼠行為是癢覺。DNFB組(n=12)小鼠經(jīng)4次藥物涂抹，第1、4、11、18天每次涂抹后30 min內(nèi)搔抓行為次數(shù)均明顯多于丙酮對照組(n=5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 面頰部模型中兩組小鼠特征行為的對比

圖2 兩組小鼠不同時間點搔抓行為的對比

2.2 MEK抑制劑U0126對慢性癢行為的抑制作用 DNFB溶液反復(fù)刺激皮膚后，會對小鼠造成明顯的皮膚病理性增生和損傷，同時會誘發(fā)小鼠自發(fā)性搔抓行為，并且這種自發(fā)性搔抓行為可持續(xù)14 d。進一步的研究結(jié)果(圖3)提示：與注射PBS相比，鞘內(nèi)注射U0126可顯著減少小鼠的自發(fā)性搔抓行為，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖3 MEK抑制劑U0126對自發(fā)性慢性癢行為的抑制作用

2.3 脊髓背角pERK參與DNFB誘導(dǎo)的慢性癢 免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果(圖4)顯示：與PBS對照組相比，鞘內(nèi)注射U0126可明顯減少pERK陽性表達神經(jīng)元的數(shù)量，最后1次涂抹DNFB后的第1、3 、7、14天分別減少了47%、59%、40%、50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.4 慢性癢背部模型pERK的神經(jīng)元定位 免疫熒光染色結(jié)果(圖4)顯示：pERK陽性表達細胞主要與NeuN共標，而不與GFAP、Iba1共標，提示pERK陽性表達細胞是神經(jīng)元細胞，與急性癢一致。pERK陽性表達細胞與表達在Ⅱ內(nèi)層的PKC-r不共標，提示pERK陽性表達神經(jīng)元依然位于脊髓背角Ⅰ層，與急性癢狀態(tài)基本一致。

圖4 兩組小鼠脊髓背角pERK陽性神經(jīng)元的對比

圖5 慢性癢背部模型pERK的神經(jīng)元定位

3 討 論

慢性癢常與皮膚炎性疾病、系統(tǒng)性疾病、免疫功能紊亂等相關(guān)，炎性介質(zhì)通過直接激活或敏化癢覺神經(jīng)元參與其中。Inagaki等[8]嘗試采用0.15% DNFB/丙酮溶液涂抹于腹部備皮區(qū)域建立小鼠過敏性皮炎并伴隨頻繁搔抓行為模型，以此來探討癢覺的發(fā)生機制，取得初步成效。面頰模型可以從行為學(xué)上將痛覺和癢覺區(qū)分出來[4]。本研究面頰部模型中，DNFB組小鼠搔抓行為(30 min內(nèi)86次)明顯超過對照組小鼠(30 min內(nèi)17次)，而擦涂行為沒有明顯區(qū)別。結(jié)果提示DNFB/丙酮誘導(dǎo)的行為是癢覺，證實慢性癢模型建立成功。為制備背部瘙癢模型，本研究在小鼠頸背部區(qū)域涂抹0.15%DNFB/丙酮溶液150 μL，在每個時間點DNFB組小鼠搔抓行為次數(shù)明顯高于對照組。但本研究的搔抓次數(shù)低于其他文獻結(jié)果[5-6]，可能與計數(shù)時間、實驗小鼠品系不同有關(guān)。為進一步驗證MEK抑制劑U0126能否對慢性癢發(fā)揮作用，本研究對小鼠進行鞘內(nèi)注射0.1 μg/μL U0126。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNFB組小鼠搔抓次數(shù)明顯減少，DNFB組pERK陽性表達神經(jīng)元數(shù)量也顯著少于對照組，與行為學(xué)結(jié)果相一致。行為學(xué)指標的檢測結(jié)果表明，本研究成功建立了DNFB誘導(dǎo)的過敏性皮炎慢性癢模型，小鼠的慢性癢可持續(xù)14 d，可用于觀察和研究脊髓背角表達pERK的神經(jīng)元對慢性癢的影響及其與MAPK通路的關(guān)系。

pERK表達增多是細胞外調(diào)節(jié)激酶活化磷酸化的標志，同時也是脊髓背角參與痛覺信號處理的標志。本課題預(yù)試驗結(jié)果證實，ERK磷酸化也是脊髓背角參與組胺釋放和DNFB誘發(fā)痛覺信號調(diào)節(jié)的標志。本研究著重探討DNFB誘發(fā)的過敏性皮炎是否會對小鼠造成慢性癢，以及脊髓在慢性癢模型中的作用。然而DNFB誘發(fā)的慢性癢需要ERK的持續(xù)磷酸化，并且使用MEK抑制劑U0126可有效地緩解搔抓行為。因此，還需要探索慢性癢模型在DRG水平的ERK表達情況，以進一步證實ERK參與癢覺的調(diào)節(jié)。

pERK陽性表達神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征對研究脊髓癢覺機制有重要作用[7-10]。為了探討DNFB誘導(dǎo)的慢性癢模型中pERK陽性表達的細胞類型及位置是否發(fā)生改變，本研究分別與NeuN(神經(jīng)元標志物)、GFAP(星形膠質(zhì)細胞標志物)和Ibal(小膠質(zhì)細胞標志物)共標。結(jié)果表明，pERK陽性表達細胞是神經(jīng)元，且pERK陽性表達神經(jīng)元依然位于脊髓背角Ⅰ層，與急性癢一致。

綜上所述，慢性癢模型中pERK陽性表達細胞仍然是神經(jīng)元，脊髓背角淺層神經(jīng)元ERK磷酸化參與了DNFB誘導(dǎo)的慢性癢的調(diào)控。

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