上調(diào)microRNA-543表達對大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的保護作用

李 坤， 張育民， 王亞康， 郭建斌

西安交通大學附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科髖關(guān)節(jié)病區(qū)，西安 710054

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一組由關(guān)節(jié)邊緣處的骨骼變化、關(guān)節(jié)軟骨完整性異常及關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨退化引起的異質(zhì)性癥候群，與多種炎性介質(zhì)、細胞因子等致病因素密切相關(guān)，是老年人群普遍存在的慢性疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量，對社會經(jīng)濟也造成了巨大的負擔[1-2]。OA的發(fā)病機制復雜，軟骨細胞在細胞外基質(zhì)(ECM)中的異常增殖、遷移導致的關(guān)節(jié)軟骨愈合、修復能力異常可能是其主要的致病原因[3]，這也是目前最主要的治療靶標。

微小RNA(microRNA/miRNA/miR)是長度在21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過對靶基因mRNA進行切割或翻譯抑制，導致蛋白質(zhì)表達下調(diào)，進而調(diào)控細胞增殖、凋亡等多個生物學過程[4]。研究[5-9]表明，一系列的miRNAs(miR-602、miR-608、miR-30、miR-146a、miR-183)可能參與了OA的發(fā)生發(fā)展，且與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)或血管細胞黏附分子-1的表達相關(guān)。

MiR-543對MMP7有調(diào)控作用，可能參與調(diào)節(jié)軟骨細胞ECM的平衡[10]，與骨肉瘤腫瘤細胞的糖酵解和增殖亢進有關(guān)[11]，但目前關(guān)于其在OA中的作用及機制尚不明確。因此，本研究基于大鼠OA模型及體外細胞實驗探討miR-543對大鼠OA模型軟骨細胞的可能作用及機制，為OA的臨床防治提供參考靶標。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 DMEM-F12培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素、胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；miR-543 mimics及相應(yīng)陰性對照、轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪基因化學科技有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒、鼠雙微體基因4(murine double minute 4, MDM4)、蛋白激酶B1(protein kinase B1, PKB1/Akt1)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 動物分組及OA模型的建立 30只健康SD大鼠購自濟南金豐實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(魯)20140006。大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，隨機均分為OA模型組及正常對照組(n=15)，正常對照組大鼠不做特殊處理，OA模型組大鼠采用0.5%水合氯醛(0.35 g/100 g)腹腔注射麻醉后切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，建立OA模型，術(shù)后每天對兩組大鼠肌內(nèi)注射青霉素2×104U/kg，共3 d。1周后，每天驅(qū)趕OA模型組及正常對照組大鼠跑步30 min。

1.3 軟骨細胞的原代培養(yǎng)及miR-543 mimics的轉(zhuǎn)染 無菌條件下取正常大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，切下組織一部分用于RNA抽提，另一部分置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗，300×g離心10 min，棄上清，20%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)基37℃、適當濕度、5%CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將待轉(zhuǎn)染細胞以2×105/cm2的密度接種于12孔板，待細胞融合達60%～80%時，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法進行轉(zhuǎn)染miR-543 mimics及相應(yīng)陰性對照(miR-543-NC)，驗證轉(zhuǎn)染效率后行后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測軟骨細胞增殖能力 取對數(shù)生長期待測軟骨細胞，96孔板中每孔接種5 000個細胞，每組設(shè)6個復孔，同時設(shè)立無細胞的空白對照。細胞轉(zhuǎn)染miR-543 mimics后，10 ng/L IL-1β處理24 h，每孔加入5 μg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄上清，加入DMSO 200 μL/孔，振蕩10 min，酶標儀讀取光密度(D490)值，重復3次。

1.5 Real-time PCR檢測軟骨細胞凋亡相關(guān)基因及炎癥因子基因的表達 原代軟骨細胞培養(yǎng)于6孔板，不轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)染miR-543 mimics或miR-543-NC 48 h后，加入10 ng/L IL-1β連續(xù)培養(yǎng)24 h，TRIzol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行real-time PCR檢測待測基因表達水平，嚴格按說明書進行操作，待測基因及內(nèi)參序列如表1。反應(yīng)條件：95℃，3 min；40個PCR循環(huán)(95℃，15 s；55℃，20 s；72℃，20 s；83.5℃，15 s)；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s。以ABI 7500實時定量PCR系統(tǒng)進行實驗，收集熒光信號，繪制熔解曲線，以2-ΔΔCt法進行相對定量分析相關(guān)基因的表達水平。

1.6 Western印跡法檢測軟骨細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達 原代軟骨細胞培養(yǎng)于6孔板，不轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)染miR-543 mimics或miR-543-NC 48 h后提取待測細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將各組蛋白與上樣緩沖液(loading buffer)充分混合后100℃變性5 min，每孔50 μL加入到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠上樣孔，進行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入按使用說明稀釋后的待測一抗4℃過夜。TBST緩沖溶液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)。37℃孵育1 h，TBST緩沖液清洗后以ECL發(fā)光液顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參分析MDM4、Akt1、Bcl-2等蛋白的表達水平。

MDM4:鼠雙微體基因4(murine double minute 4); Akt1:蛋白激酶B1(protein kinase B1, PKB1); Bcl-2:B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2); TNF-α:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α); IL-6:白細胞介素-6(interleukin-6)

2 結(jié) 果

2.1 MiR-543在OA模型大鼠軟骨組織及IL-1β誘導的軟骨細胞中的表達變化 結(jié)果(圖1)表明：大鼠OA模型組軟骨組織miR-543表達較正常對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與未接受IL-1β誘導的軟骨細胞相比，IL-1β誘導后的軟骨細胞miR-543表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 OA模型大鼠軟骨組織及IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-543的表達

2.2 軟骨細胞miR-543轉(zhuǎn)染效率驗證 結(jié)果(圖2)表明：miR-543-NC轉(zhuǎn)染組軟骨細胞miR-543表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義； miR-543-mimics轉(zhuǎn)染組軟骨細胞miR-543表達較對照組明顯升高(P<0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染后不同組別軟骨細胞miR-543的表達

2.3 上調(diào)miR-543表達對軟骨細胞增殖能力的影響 結(jié)果(圖3)表明：與正常對照軟骨細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-543 mimics后軟骨細胞增殖率明顯提升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與正常對照軟骨細胞相比，IL-1β誘導可導致軟骨細胞增殖能力下降(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-543 mimics上調(diào)miR-543表達后可逆轉(zhuǎn)IL-1β對細胞增殖的抑制作用(P<0.05)。

2.4 上調(diào)miR-543表達對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響 結(jié)果(圖4)表明：與正常對照軟骨細胞相比，miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細胞MDM4

mRNA表達下調(diào)，Akt1、Bcl-2 mRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與正常對照軟骨細胞相比，IL-1β誘導后細胞MDM4 mRNA表達上調(diào)，Akt1、Bcl-2 mRNA表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-543 mimics可減輕IL-1β誘導的MDM4、Akt1、Bcl-2 mRNA 表達變化(P<0.05)。

圖3 上調(diào)miR-543表達對軟骨細胞增殖能力的影響

圖4 上調(diào)miR-543表達對軟骨細胞MDM4、Akt1、Bcl-2 mRNA表達的影響

2.5 上調(diào)miR-543表達對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響 結(jié)果(圖5)表明：與正常對照組相比，IL-1β誘導后軟骨細胞炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達上調(diào)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-543 mimics上調(diào)miR-543表達可減輕IL-1β誘導的TNF-α、IL-6 mRNA表達變化(P<0.05)。

圖5 上調(diào)miR-543表達對軟骨細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響

2.6 上調(diào)miR-543表達對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 結(jié)果(圖6)表明：與正常對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-543 mimics軟骨細胞MDM4表達下降，Akt1、Bcl-2表達上升(P<0.05)；與正常對照組相比，IL-1β誘導后軟骨細胞MDM4表達上升，Akt1、Bcl-2表達下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-543 mimics上調(diào)miR-543表達可減少IL-1β誘導的MDM4、Akt1、Bcl-2蛋白表達的變化。

圖6 上調(diào)miR-543表達對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

1：對照組； 2： miR-543-mimics； 3： IL-1β； 4： miR-543-mimics+IL-1β

3 討 論

本研究結(jié)果表明miR-543在骨軟骨炎大鼠軟骨組織中表達明顯下降，提示miR-543正常表達可能對維持軟骨細胞的正常生理功能有重要意義。MiR-543功能獲得性實驗發(fā)現(xiàn)，miR-543可促進軟骨細胞增殖(P<0.05)，減輕IL-1β誘導的增殖抑制作用(P<0.05)，提示miR-543表達抑制可能是OA的分子生物學病因之一，miR-543表達水平的監(jiān)測對于OA的發(fā)生及病情評估有潛在的臨床價值。外源性miR-543補充對于緩解骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展具有積極意義。

軟骨細胞異常凋亡是骨關(guān)節(jié)炎進展的重要原因之一，MDM4可定位于凋亡的關(guān)鍵細胞器線粒體，激活TP53線粒體凋亡途徑，還可結(jié)合并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2功能，促進細胞色素C的釋放，產(chǎn)生促凋亡作用[12]。Akt1則可調(diào)控mTOR信號通路，減少細胞凋亡[13]。MiR-543過表達的軟骨細胞與對照細胞相比，MDM4表達降低，Bcl-2、Akt1表達升高。在IL-1β誘導下，miR-543表達可減少促凋亡蛋白MDM4的釋放，提高凋亡抵抗蛋白Bcl-2、Akt1的水平。在后續(xù)研究中，還需借助生物信息學分析及熒光素酶報告實驗研究證實miR-543對MDM4、Akt1、Bcl-2是否存在直接的調(diào)控作用。

OA發(fā)病過程中，炎癥因子的過表達與OA的嚴重程度密切相關(guān)，大量炎癥因子釋放不僅會造成軟骨細胞損傷，還可影響軟骨細胞分化、誘導ECM降解[14-15]。IL-1β誘導軟骨細胞時，發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α、IL-6表達明顯上升(P<0.05)，提示IL-1β可造成軟骨細胞炎癥損傷，而miR-543過表達時，TNF-α、IL-6表達被抑制(P<0.05)，提示miR-543可能還有減輕炎癥損傷的作用。

綜上所述，OA大鼠軟骨組織與正常軟骨組織相比miR-543表達明顯下調(diào)。過表達miR-543可促進軟骨細胞增殖，下調(diào)MDM4蛋白表達，上調(diào)Akt1、Bcl-2蛋白表達，導致炎癥因子TNF-α、IL-6表達降低，可拮抗IL-1β誘導的增殖抑制、促凋亡蛋白上調(diào)、抗凋亡蛋白下調(diào)、促炎癥因子產(chǎn)生作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

[ 1 ] DAMMAN W, LIU R, KROON F P, et al.Do comorbidities play a role in hand osteoarthritis disease burden? Data from the hand osteoarthritis in secondary care cohort[J].J Rheumatol,2017, 44(11):1659-1666.

[ 2 ] 陳 亮，楊曉凌.骨關(guān)節(jié)炎患者血清中炎性因子IL-1β、IL-6和COX-2的表達[J].中國臨床醫(yī)學,2016,23(1)：61-62.

[ 3 ] BADAWY M, FENSTAD A M, BARTZ-JOHANNESSEN C A, et al. Hospital volume and the risk of revision in Oxford unicompartmental knee arthroplasty in the Nordic countries -an observational study of 14,496 cases[J].BMC Musculoskelet Disord, 2017,18(1):388.

[ 4 ] SHAH R, YERI A S, DAS A, et al. Small RNA-seq during acute maximal exercise reveal RNAs involved in vascular inflammation and cardiometabolic health: brief report[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2017,313(6):H1162-H1167.

[ 5 ] BEYER C, ZAMPETAKI A, LIN N Y, et al.Signature of circulating microRNAs in osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2015,74(3):e18.

[ 6 ] AKHTAR N, MAKKI M S, HAQQI T M.MicroRNA-602 and microRNA-608 regulate sonic hedgehog expression via target sites in the coding region in human chondrocytes[J].Arthritis Rheumatol, 2015,67(2):423-434.

[ 7 ] LI L, YANG C, LIU X, et al. Elevated expression of microRNA-30b in osteoarthritis and its role in ERG regulation of chondrocyte[J]. Biomed Pharmacother, 2015,76:94-99.

[ 8 ] YAMASAKI K, NAKASA T, MIYAKI S, et al. Expression of MicroRNA-146a in osteoarthritis cartilage[J]. Arthritis Rheum, 2009,60(4):1035-1041.

[ 9 ] LI X, KROIN J S, KC R, et al. Altered spinal microRNA-146a and the microRNA-183 cluster contribute to osteoarthritic pain in knee joints[J]. J Bone Miner Res, 2013,28(12):2512-2522.

[10] SONG N, LIU H, MA X, et al. Placental growth factor promotes metastases of ovarian cancer through MiR-543-regulated MMP7[J]. Cell Physiol Biochem, 2015,37(3):1104-1112.

[11] ZHANG M, LYGRISSE K, WANG J. Role of microRNA in osteoarthritis[J]. J Arthritis, 2017,6(2).pii:239.

[12] MANCINI F, PIERONI L, MONTELEONE V, et al. MDM4/HIPK2/p53 cytoplasmic assembly uncovers coordinated repression of molecules with anti-apoptotic activity during early DNA damage response[J].Oncogene, 2016,35(2):228-240.

[13] TANG H, CHEN J, FRAIDENBURG D R, et al. Deficiency of Akt1, but not Akt2, attenuates the development of pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2015,308(2): L208-L220.

[14] DA SILVA M R, LINHARES D, VASCONCELOS D M, et al.Neuroimmune expression in hip osteoarthritis: a systematic review[J].BMC Musculoskelet Disord, 2017,18(1):394.

[15] MA C H, WU C H, JOU I M, et al. PKR activation causes inflammation and MMP-13 secretion in human degenerated articular chondrocytes[J].Redox Biol, 2018,14:72-81.