黑龍江省稗草對三種玉米田常用除草劑抗藥性研究

劉亞光，唐興佳，劉藍坤，朱金文，張建樹

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，杭州 310029）

雜草是影響作物產(chǎn)量主要因素。稗草[Echino?chloa crusgalli（L.）Beauv]屬于稗屬一年生禾本科雜草，是玉米田主要惡性雜草，根系發(fā)達、再生力強，不易清除[1]。稗草密度達20株·m-2時可使玉米減產(chǎn)15%。為減少雜草對玉米影響，除草劑應用廣泛。目前黑龍江省玉米田防除稗草常用除草劑主要有乙草胺、莠去津、煙嘧磺隆和硝磺草酮等，已連續(xù)應用多年，乙草胺、莠去津和煙嘧磺隆近年用量均保持在每年2 000 t，硝磺草酮年用量也達1 000 t。長期大量使用除草劑導致雜草抗藥性增強，Giannopolitis等報道美國馬里蘭州稗草對莠去津產(chǎn)生抗性[2]，加拿大和法國也在玉米田內(nèi)檢測到抗莠去津稗草[3-4]，孫會杰等研究表明玉米田反枝莧（Amaranthus retroflexus）對莠去津抗性水平處于敏感性下降階段[5]。張宏軍等在我國東北、華北地區(qū)發(fā)現(xiàn)對煙嘧磺隆抗性達1 100倍的馬唐（Digi?taria sanguinali）[6]。井秋月等報道黑龍江省部分地區(qū)稗草對煙嘧磺隆產(chǎn)生抗性[7]。但未見有關(guān)黑龍江省玉米田稗草對乙草胺、莠去津和硝磺草酮抗性研究。

雜草對除草劑抗性主要分為靶標抗性和非靶標抗性兩大類。除草劑作用位點改變是抗性產(chǎn)生原因之一，Hernández等研究表明假高粱（Sorghum halepense）因ALS酶作用位點改變對煙嘧磺隆產(chǎn)生靶標抗性[8]。靶標酶基因表達量變化也可導致雜草產(chǎn)生靶標抗性，EPSPS（5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶）為作用靶標的草甘膦，過量5～17倍的EPSPS可對草甘膦至少增加8倍抗性[9]。很多雜草對ALS抑制劑中磺酰脲類和咪唑啉酮類、ACCase抑制劑類及二硝基苯胺類除草劑產(chǎn)生抗性是由于除草劑作用點改變引起，而三氮苯類、酰胺類以及取代脲類PSII抑制劑抗性產(chǎn)生大多涉及非靶標抗性機制。

非靶標抗性也是雜草抗性產(chǎn)生的重要原因，植物通過提高對除草劑軛和作用、降解作用及清除除草劑產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物解毒能力，對除草劑產(chǎn)生抗性，非靶標抗性大多抗性水平不高。雜草體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transfer?ase，GSTs）、超氧化物歧化酶（Superoxide dis?mutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）等均與雜草對除草劑解毒代謝能力有關(guān)[10]。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是植物體內(nèi)主要解毒代謝酶，GSTs酶在大部分抗性雜草體內(nèi)，可快速將除草劑轉(zhuǎn)變成對植物無毒化合物。吳小虎等報道，谷胱甘肽（Glutathione）共軛作用可增強其解毒能力使苘麻（Abutilon theo?phrasti）對莠去津產(chǎn)生抗性[11]。稗草[12]、狗尾草[13]、黑麥草[14]、大穗看麥娘[15]除草劑抗性均由抗性生物型體內(nèi)GSTs酶對除草劑解毒活性增強導致，三氮苯類除草劑重要解毒機制之一為抗性雜草體內(nèi)GSTs活性和解毒能力增強[16]。Pyon等研究表明，小飛蓬（Erigeron canadensis）對草甘膦產(chǎn)生抗性可能是由抗氧化酶系活性提高和還原型谷胱甘肽含量升高共同導致[17]。

本研究以采自黑龍江省12個主要玉米產(chǎn)區(qū)稗草為試驗材料，開展其對乙草胺、莠去津和硝磺草酮抗性水平測定，同時測定稗草體內(nèi)SOD、POD、CAT和GSTs酶活性。旨在明確黑龍江省玉米田稗草對乙草胺、莠去津和硝磺草酮抗性水平，初步探討稗草體內(nèi)酶與稗草產(chǎn)生抗性關(guān)系，為進一步研究稗草抗性機制奠定基礎。同時為該抗性雜草治理及黑龍江省農(nóng)業(yè)“三減”政策中除草劑減量使用提供理論依據(jù)，為黑龍江省玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

供試稗草種子采集于黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)（農(nóng)大）、青岡縣、通河縣、肇東市、五常市、雞西市、湯原縣、哈爾濱市阿城區(qū)、牡丹江市東京城鎮(zhèn)、賓縣、鐵力市、齊齊哈爾（齊市）12個地區(qū)田塊，將采集成熟種子帶回實驗室，晾干后裝紙袋保存待用。

1.1.2 供試除草劑

38%莠去津懸浮劑（購自吉林金秋農(nóng)藥有限公司）；15%硝磺草酮懸浮劑（購自吉林金秋農(nóng)藥有限公司）；90%乙草胺乳油（購自美國孟山都公司）。

1.1.3 供試藥劑

Tris-HCl緩沖液、1-氯-2,4-二硝基苯（CD?NB）、還原型谷胱甘肽、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、無水乙醇、磷酸緩沖液、甲硫氨酸（Met）、氮藍四唑（NBT）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）、核黃素（FD）、1%愈創(chuàng)木酚、氯化硫胺素焦磷酸鹽（TPP）、丙酮酸鈉、1-萘酚、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、NaOH、KNO3、硫酸銨、肌酸、氯化鎂、石英砂、30%H2O2。

1.1.4 供試儀器

微量移液器（購自Gilson公司）；離心機（購自日本日立公司）；電熱恒溫水浴鍋HWS-28（購自上海一恒科學儀器有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計TU-1901（購自北京普析通用儀器有限責任公司）；背負式WS-18D電動噴霧器（購自山東衛(wèi)士）。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂法測定稗草對三種除草劑抗性

選取飽滿、均勻稗草種子，打破休眠。在預備試驗基礎上，配制表1濃度梯度藥液，將藥液與6‰瓊脂液均勻混合裝入口徑6.2 cm高9 cm塑料杯內(nèi)，冷卻備用，以不加藥劑瓊脂液為對照，選取長勢一致且剛露白種子，于各處理瓊脂表面均勻接種10粒稗草種子，3次重復。保鮮膜封住杯口保持濕潤，置于（28±5）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照/黑暗：12 h/12 h）。處理后72 h測量芽長，計算IC50，根據(jù)IC50明確抗性生物型。

表1 瓊脂法藥劑濃度Table 1 Concentrations of different herbicides in agar methods (μL·L-1)

1.2.2 整株盆栽法測定稗草對三種除草劑抗性

1.2.2.1 整株盆栽法測定稗草對乙草胺和莠去津抗藥性

第一步：播種。將未施用除草劑，經(jīng)風干過篩后土壤裝入直徑14 cm塑料盆缽內(nèi)，澆足底水，均勻播種10粒稗草種子，種子表面覆蓋1 cm細土，置于室外培養(yǎng)。第二步：施藥。配制如表2濃度梯度乙草胺和莠去津藥液，于播種1 d后，背負式噴霧器土壤處理，設置3次重復，對照為清水處理。第三步：調(diào)查。于施藥后30 d剪取地上部分，稱量鮮重，計算鮮重抑制率并求出抑制中劑量值（ED50）和抗性指數(shù)。

1.2.2.2 整株盆栽法測定稗草對硝磺草酮抗藥性

第一步：播種。將未施用除草劑，經(jīng)風干過篩后土壤裝入直徑14 cm塑料盆缽內(nèi)，澆足底水，均勻播種20粒稗草種子，種子表面覆蓋1 cm細土；室外自然條件下培養(yǎng)，出苗后間苗，每桶保留10株。第二步：施藥。配制如表2濃度梯度莠去津、硝磺草酮和乙草胺藥液，待稗草長到3～5葉期時，背負式噴霧器噴霧處理，設置3次重復，對照為清水處理。第三步：調(diào)查。于施藥后15 d剪取地上部分，稱量鮮重，計算鮮重抑制率、抑制中劑量值（ED50）和抗性指數(shù)。

表2 整株盆栽法藥劑濃度Table 2 Concentration of different herbicides in the whole plant method (g a.i·hm-2)

1.2.3 莠去津?qū)Σ煌剐运桨薏菝富钚杂绊?/p>

稗草對莠去津酶活性測定試驗于2016年2～3月在東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院雜草生測實驗室內(nèi)完成。

1.2.3.1 供試材料準備

莠去津材料采集方法：選取賓縣稗草種子，記作高抗性生物型（R），五常稗草種子記作中等抗性生物型（M），農(nóng)大稗草種子記作敏感性生物型（S），將濾紙平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿注入5 mL 0.083 mL·L-1莠去津藥液，以清水為對照，并放入適量對應生物型稗草種子，置于（28±5）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照/黑暗：12 h/12 h），于整株盆栽法噴藥前1 d、噴藥后第1、3、5、7、9、11、13 d分別采樣，記為0、1、3、5、7、9、11、13 d，取樣后放于冰箱保存待用。

1.2.3.2 莠去津?qū)OD酶活性測定

超氧化物歧化酶測定參照并改進高越方法[18]。①提取酶液。取0.2 g稗草葉片放入研缽中，加入2 mL pH 7.8磷酸緩沖液研磨，勻漿倒入3 mL離心管中，于10 000 r·min-1下冷凍離心20 min，上清夜為試驗用粗提液，置于0～4℃下保存待用。②測定SOD酶活性。按母液順序配制SOD反應液，磷酸緩沖液∶Met∶NBT∶EDTA-Na2∶核黃素（FD）∶H2O比例為15∶3∶3∶3∶3∶2.5。取型號相同試管，吸取0.05 mL酶液，加入2.95 mL反應液，4 000 lx照光30 min（盡量保證照光一致）；同時取4支試管，2支不加酶液，以pH 7.8磷酸緩沖液代替，其中1支置暗處，作空白；另1支作對照（CK）與酶液同置于4 000 lx條件下照光30 min，遮光保存，以空白調(diào)零，560 nm比色。③超氧化物歧化酶活性測定和計算。置暗處加入緩沖液試管作空白調(diào)零，其余管560 nm下測定吸光值，已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。

式（1）中，SOD酶活性以每克鮮重酶單位表示；ACK表示光照對照管吸光值；AE表示樣品管吸光值；V表示樣液總體積（mL）；Vt表示測定樣品用量（mL）；W表示樣重（g）。

1.2.3.3 莠去津?qū)OD酶活性測定

①提取酶液。取0.2 g稗草葉片放入研缽中，加入2 mL pH 7.8磷酸緩沖液研磨，勻漿倒入3 mL離心管中，于10 000 r·min-1下冷凍離心20 min，上清夜為試驗用粗提液，置于0～4℃下保存待用。②測定POD酶活性。POD酶活性測定反應：取10 mmol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液2.2 mL，0.6 mL 1%愈創(chuàng)木酚，0.05 mL酶液于試管中，加入0.15 mL H2O2后反應開始，室溫或37℃水浴5 min，以磷酸緩沖液代替酶液為對照調(diào)零。③過氧化物酶活性測定和計算。470 nm下每隔1 min讀數(shù)1次，共讀3次，以每分鐘吸光度變化值表示酶活力。

式（2）中，△470為反應時間內(nèi)吸光度變化；t為反應時間（min）；Vs表示測定時取用酶液體積（mL）；Vt表示提取酶液總體積（mL）；W表示樣重（g）。

1.2.3.4 莠去津?qū)AT酶活性測定

①提取酶液。取0.2 g稗草葉片放入研缽中，加入2 mL pH 7.8磷酸緩沖液研磨，勻漿倒入3 mL離心管中，10 000 r·min-1下冷凍離心20 min，上清夜為試驗用粗提液，0～4℃下保存待用。②測定CAT酶活性。CAT酶活性測定反應：取10 mmol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液2.865 mL和0.1 mL酶液。25℃水浴5 min后，逐管加入0.035 mL H2O2反應液，沸水浴10 min對照管調(diào)零。③過氧化氫酶活性測定和計算。每管加入H2O2反應液后計時，迅速倒入石英比色杯中，240 nm下比色，每隔1 min讀數(shù)1次，共讀數(shù)3次。

1.2.3.5 莠去津?qū)入赘孰?S-轉(zhuǎn)移酶活性測定

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）測定參照并改進Pamela等方法[19]。①提取酶液。取0.2 g稗草新鮮組織，加入3 mL pH 7.5、0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液冰塊上研磨，將勻漿液于4℃，12 000 r·min-1離心20 min，上清夜為試驗用粗酶提取液。②測定GSTs酶活性。取0.5 mL的3 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，加入pH 6.5磷酸緩沖液2.3 mL，再加入10 μL粗酶提取液，最后加入0.15 mL 96%無水乙醇配制的20 mmol·L-1CDNB，分光光度計測定340 nm處OD值，GSTs活性以OD340nm表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 抗性指數(shù)計算

將IC50（ED50）最小稗草生物型定為敏感生物型，其他稗草生物型IC50（ED50）與之對比，根據(jù)抗性指數(shù)=抗性生物型IC50/敏感生物型IC50，計算抗性指數(shù)（RI），RI越大表示該生物型抗性越強[20]?？剐运皆u價參考文獻[21]。當RI＜3時，處于敏感階段；RI在3～5時，為敏感性下降階段；RI在5～10時，處于低水平抗性階段;RI在10～40時，為中等水平抗性階段；RI在40～60時，處于高水平抗性階段；RI＞160時，處于極高水平抗性階段。

1.3.2 酶活性用活性變化率表示

式（5）中，A1表示除草劑處理后SOD活性，A0表示清水對照SOD活性。

GSTs酶、POD酶、CAT酶活性變化率計算同SOD。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稗草生物型對3種除草劑抗性測定結(jié)果

利用瓊脂法和整株盆栽法檢測黑龍江省12個地區(qū)稗草生物型對莠去津、乙草胺和硝磺草酮抗性，各地區(qū)用不同方法測定結(jié)果及抗性指數(shù)分級如下所述。其中M代表中等水平抗性、L代表低等水平抗性、D代表敏感性下降階段、S代表敏感階段。

2.1.1 不同稗草生物型對莠去津抗性測定結(jié)果

由表3可知，瓊脂法測定結(jié)果表明，農(nóng)大生物型稗草對莠去津表現(xiàn)最為敏感，IC50值為536.4599 μL·L-1，以此稗草為敏感生物型，作為計算其他生物型抗性指數(shù)標準。其中賓縣生物型對莠去津抗性指數(shù)為5.25，產(chǎn)生低等水平抗性；五常和佳木斯生物型對莠去津抗性指數(shù)分別為3.72和3.31，屬于敏感性下降階段；肇東等其他8個生物型的抗性水平均低于3，處于敏感階段。

整株法測定結(jié)果與瓊脂法基本一致，符合度達83.33%。農(nóng)大生物型對莠去津表現(xiàn)最為敏感，因此將其作為敏感生物型，計算其他生物型抗性指數(shù)。賓縣生物型抗性指數(shù)為5.01，產(chǎn)生低等水平抗性；雞西和五常生物型抗性指數(shù)分別為3.40和3.23，屬于敏感性下降階段；肇東等其他8個生物型抗性水平均低于3，處于敏感階段。

2.1.2 不同稗草生物型對硝磺草酮抗性測定結(jié)果

由表4可知，瓊脂法測定結(jié)果表明，農(nóng)大生物型稗草對硝磺草酮 IC50值最低為 81.8924 μL·L-1，以此IC50值作為計算其他生物型抗性指數(shù)標準，雞西等11個稗草生物型IC50值139.5284～219.969 μL·L-1，抗性指數(shù)在1.70～2.69，均低于3，處于敏感階段。

整株法測定結(jié)果與瓊脂法一致，符合度達100%。農(nóng)大生物型對莠去津表現(xiàn)最為敏感，因此將其作為敏感生物型，計算其他生物型抗性指數(shù)。雞西等11個生物型抗性指數(shù)1.08～2.15，均低于3，并未對硝磺草酮產(chǎn)生抗性。

表3 兩種測定方法稗草對莠去津抗性測定結(jié)果Table 3 Comparison of resistance of barnyardgrass to atrazine determined by two methods

表4 兩種測定方法稗草對硝磺草酮抗性測定結(jié)果Table 4 Comparison of resistance of barnyardgrass to mesotrione determined by two methods

2.1.3 不同稗草生物型對乙草胺抗性測定結(jié)果

兩種測定方法稗草對乙草胺抗性測定結(jié)果見表5。由表5可知，瓊脂法測定結(jié)果表明，農(nóng)大生物型稗草對莠去津表現(xiàn)最敏感，IC50值0.1842 μL·L-1，以此稗草作為敏感生物型，作為計算其他生物型抗性指數(shù)標準。佳木斯等11個生物型抗性指數(shù)1.59～2.95，均低于3，處于敏感階段。

整株法測定結(jié)果與瓊脂法一致，符合度達100%。農(nóng)大生物型對莠去津表現(xiàn)最為敏感，因此將其作為敏感生物型，計算其他生物型抗性指數(shù)。佳木斯等11個生物型抗性指數(shù)1.17～2.58，均低于3，并未對乙草胺產(chǎn)生抗性。

表5 兩種測定方法稗草對乙草胺抗性測定結(jié)果Table 5 Comparison of resistance of barnyardgrass to acetochlor determined by two method

2.2 莠去津?qū)Π薏菝富钚杂绊?/h3>

2.2.1 莠去津?qū)Π薏軸OD酶活性影響

同一位超聲科醫(yī)生檢查。采用SIMENS ACUSON X-300型的彩色多普勒超聲診斷儀，超聲探頭頻率范圍：7.5～12.0 MHZ。采用縱橫切面探查頸動脈，觀察有無動脈粥樣硬化斑塊。測量IMT，IMT＞50%周圍血管IMT，或IMT＞1.5 mm且為低回聲或混合回聲視為存在不穩(wěn)定斑塊，強回聲視為穩(wěn)定斑塊。

以施用清水和莠去津的賓縣、五常和農(nóng)大生物型稗草組織為研究對象，分別記作抗性生物型（R）、中等抗性生物型（M）、敏感性生物型（S），即農(nóng)大（S）、五常（M）和賓縣（R），研究3種不同種生物型內(nèi)SOD酶變化率（見圖1）。施用莠去津2 d后，SOD酶活性變化率為農(nóng)大（S）＞五常（M）＞賓縣（R），五常（M）和賓縣（R）均與敏感生物型農(nóng)大（S）差異顯著；第3天時，五常（M）＞農(nóng)大（S）＞賓縣（R），賓縣（R）與敏感生物型農(nóng)大（S）差異顯著，而五常（M）與敏感生物型農(nóng)大（S）差異不顯著；第7天時，SOD酶變化率為賓縣（R）＞農(nóng)大（S）＞五常（M），賓縣（R）與五常（M）和農(nóng)大（S）均差異顯著。由此可見，3種生物型SOD酶活性變化率無規(guī)律，說明稗草對莠去津產(chǎn)生抗性與體內(nèi)SOD酶活性無關(guān)。

圖1 不同處理時間SOD酶活性變化Fig.1 Change of SOD activity at different treatment times

2.2.2 莠去津?qū)Π薏軨AT酶活性影響

試驗材料和處理方法同2.2.1，研究3種不同生物型體內(nèi)CAT酶活性不同時間內(nèi)變化情況（見圖2）。

施用莠去津2 d后，CAT酶活性變化率為農(nóng)大（S）＞五常（M）＞賓縣（R）；第3天時五常（M）＞農(nóng)大（S）＞賓縣（R）；第7天時，CAT酶活性變化率為賓縣（R）＞農(nóng)大（S）＞五常（M）。第2、3和7天時，3種生物型間CAT酶活性變化率均差異顯著。3種生物型CAT酶活性變化并無規(guī)律，因此稗草CAT酶活性與其對莠去津產(chǎn)生抗性無關(guān)。

圖2 不同處理時間CAT酶活性變化Fig.2 Change of CAT enzyme activity at different treatment time

2.2.3 莠去津?qū)Π薏軵OD酶活性影響

試驗材料和處理方法同2.2.1，研究不同稗草生物型體內(nèi)POD活性變化情況（見圖3）。農(nóng)大（S）、五常（M）和賓縣（R）3個生物型施用莠去津后11 d內(nèi)，各生物型稗草體內(nèi)POD活性變化率趨勢均呈先升再降趨勢。0～11 d農(nóng)大（S）POD酶活性平均變化率為16.72%，第5天達到高峰，峰值46.51%；五常（M）POD酶活性平均變化率為31.96%，也是第5天達到高峰，峰值133.33%；賓縣（R）在11 d內(nèi)POD酶活性平均變化率為88.45%，第3天達到峰值234.38%，同期賓縣（R）POD酶活性變化率與農(nóng)大（S）間差異極顯著，五常（M）與農(nóng)大（S）間達差異極顯著，賓縣（R）與五常（M）間差異達極顯著。POD酶活性平均變化率和峰值順序均為賓縣（R）＞五常（M）＞農(nóng)大（S），可知，稗草體內(nèi)POD酶活性與莠去津抗性呈正相關(guān)。

2.2.4 莠去津?qū)Π薏軬STs酶活性影響

試驗材料和處理方法同2.2.1，研究不同生物型稗草體內(nèi)GSTs酶活性變化情況（見圖4）。

由圖4可知，施用莠去津后11 d內(nèi)，各生物型稗草體內(nèi)GSTs活性變化率均呈先升再降趨勢。0～11 d農(nóng)大（S）GSTs酶活性平均變化率為17.52%，第3天達到高峰，酶活性變化率峰值為39.29%；五常（M）GSTs酶活性平均變化率為33.08%，第3天達到高峰，酶活性變化率峰值為94.29%；賓縣（R）GSTs酶活性平均變化率為58.32%，于第5天達到高峰，酶活性變化率峰值為122.58%，此時賓縣（R）、五常（M）和農(nóng)大（S）3個生物型體內(nèi)GSTs酶活性差異極顯著，GSTs酶活性平均變化率和峰值順序均為：賓縣（R）＞五常（M）＞農(nóng)大（S），由此可見稗草體內(nèi)GSTs酶活性與其對莠去津抗性呈正相關(guān)。

圖3 不同處理時間POD酶活性變化Fig.3 Change of POD enzyme activity at different treatment time

圖4 不同處理時間GSTs活性變化Fig.4 Change of GSTs enzyme activity at different treatment time

3 討 論

3.1 不同稗草生物型對3種除草劑抗性水平

采用瓊脂法和整株盆栽法測定黑龍江省12個地區(qū)玉米田稗草生物型對莠去津、乙草胺和硝磺草酮抗性水平。檢測出稗草對莠去津產(chǎn)生抗性，賓縣生物型對莠去津產(chǎn)生低等水平抗性，占比8.3%；雞西和五常生物型屬于敏感性下降階段，占比16.7%；其余生物型處于敏感階段，占比75%；12種生物型稗草均未對乙草胺和硝磺草酮產(chǎn)生抗性，但黑龍江省其他地區(qū)稗草對乙草胺和硝磺草酮是否產(chǎn)生抗性仍不確定，需擴大檢測范圍方可確定。

本研究首次發(fā)現(xiàn)黑龍江省玉米田稗草對莠去津產(chǎn)生抗性。雖然抗性僅達低等水平且抗性生物型占比不高，但抗性雜草在田間具有一定適合度和競爭力，在高濃度藥劑定向選擇下，抗性群體將逐漸擴大，抗性水平也逐漸提高，給莠去津防除玉米田稗草帶來一定風險。Gronwald等在馬里蘭州發(fā)現(xiàn)苘麻對莠去津產(chǎn)生10倍于敏感生物型抗性，Gray等試驗結(jié)果表明，馬里蘭州苘麻對莠去津抗性已達敏感生物型100倍[22-23]。因此應對莠去津抗性發(fā)展給予重視，加強黑龍江省玉米田稗草抗性監(jiān)測力度，逐步擴大抗性稗草生物型監(jiān)測范圍，及時了解抗性稗草生物型發(fā)展動態(tài)。

目前黑龍江省土壤處理劑以乙草胺、莠去津、異丙甲草胺、嗪草酮及其混劑為主[24]，特別是乙莠混劑近年發(fā)展迅速，已成為玉米田苗前除草主導產(chǎn)品。莖葉處理除草劑中莠去津和煙嘧磺隆及煙莠混劑用量最大，吳翠霞等報道玉米田中稗草已對煙嘧磺隆產(chǎn)生抗性[25]。因此，生產(chǎn)中應減少莠去津及其混劑用量，盡量選取不同類型除草劑替換使用。封閉處理時乙草胺盡量選擇與嗪草酮、異惡草酮和苯嘧磺草胺等除草劑混用，莖葉處理時可將莠去津與硝磺草酮、噻吩磺隆等除草劑混用。此外，還要結(jié)合輪作、耕作、生態(tài)等多種措施綜合防控，避免化學除草主導下抗性稗草發(fā)生和蔓延。

3.2 瓊脂法與整株盆栽法測定稗草對除草劑抗性符合度分析

瓊脂法和整株盆栽法是目前雜草研究者廣泛應用的測定雜草抗藥性水平方法。瓊脂法靈敏度高、操作簡單；整株盆栽法中除草劑活性及使用情況類似田間，為最適宜抗性鑒定方法[26]，但測定種群數(shù)量較多時工作量大，試驗周期較長。

本試驗采用瓊脂法和整株盆栽法測定12個地區(qū)稗草生物型對三種除草劑抗性水平，通過確定兩種方法符合度明確瓊脂法能否代替最接近田間實際情況的整株盆栽法鑒定稗草對除草劑抗藥性。結(jié)果表明，采用瓊脂法和整株盆栽法對供試12個稗草生物型作抗性測定，對硝磺草酮和乙草胺抗性分級一致；對莠去津抗性分級符合度為83.33%。因此在檢測稗草生物型對莠去津、乙草胺和硝磺草酮是否產(chǎn)生抗藥性時，為確保省時省力、結(jié)果準確，可先利用更為靈敏、簡便瓊脂法初步測定，然后整株盆栽法進一步驗證可疑稗草種群。

3.3 稗草體內(nèi)酶活性與其對莠去津抗性關(guān)系

通常情況下，植物體內(nèi)處于活性氧平衡狀態(tài)，但植物受除草劑、干旱、低溫、病、蟲、鹽堿及澇害逆境脅迫后，活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)平衡被打破，活性氧自由基在植物體內(nèi)不斷累積，對植物產(chǎn)生毒害作用，引起生物膜損傷。SOD、POD、CAT等酶組成植物抗氧化保護酶體系，在脅迫條件下可通過自身防御機制作出保護性應激反應，有效阻止活性氧在植物體內(nèi)積累，避免生物膜受傷害[27]。

本研究中抗性生物型稗草在施用莠去津后POD酶活性升高，且與對莠去津抗性程度呈正相關(guān)?？赡芤蚴┯幂ソ蚝螅薏蒹w內(nèi)發(fā)生氧化脅迫反應產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)H2O2，脅迫反應產(chǎn)生的H2O2在植物體內(nèi)主要由POD酶催化轉(zhuǎn)換成H2O和無毒物質(zhì)，因此POD酶活性高的生物型對莠去津抵御能力越強。李萍等研究顯示，大部分谷子品種對撲草凈有耐藥性原因是撲草凈藥劑處理后谷子POD酶活性提高[28]。馬鵬生報道豬殃殃對雙氟磺草胺抗性可能是因為POD酶對雙氟磺草胺產(chǎn)生一種保護機制，與SOD活性變化無明顯關(guān)系[29]。畢亞玲等研究表明麥田薺菜對苯磺隆產(chǎn)生抗性與CAT酶活性無關(guān)[30]。賓縣（R）、五常（M）、農(nóng)大（S）3種生物型SOD和CAT酶活性無明顯變化規(guī)律，與稗草對莠去津抗性程度無關(guān)，因此SOD和CAT酶活性與對莠去津抗性產(chǎn)生無關(guān)。

GSTs酶是植物體內(nèi)重要代謝解毒酶，也是非靶標抗性關(guān)鍵酶。GSTs酶對大多數(shù)如三氮苯、氯代乙酞胺、芳氧苯氧丙酸、二苯醚等類除草劑在植物體內(nèi)代謝起重要作用，GSTs酶通過綴合作用完成代謝導致除草劑失活，使雜草產(chǎn)生抗性[31]。Huffman等研究表明長芒莧對莠去津代謝解毒能力增強產(chǎn)生抗性[32]，Wright等研究證實GSTs酶參與稗草對精喹禾靈非靶標抗性機制[33]。本研究中，3種生物型施藥后GSTs酶活性變化趨勢相同，上升后恢復初始狀態(tài)。3種生物型GSTs酶活性平均變化率與峰值時酶活性均為：賓縣（R）＞五常（M）＞農(nóng)大（S），與稗草對莠去津抗性水平呈正相關(guān)。可能由于雜草體內(nèi)GSTs催化自身還原型谷胱甘肽（GSH）中巰基基團對除草劑作親核攻擊，兩者結(jié)合后減少除草劑形成某些中間產(chǎn)物造成雜草損害，GSTs酶活性越高，對除草劑抵御能力越強。王彥輝等研究表明廣西省甘蔗田馬唐對莠去津產(chǎn)生抗性是馬唐體內(nèi)GSTs酶活性增強導致[34]。GSTs酶活性升高可能是賓縣（R）和五常（M）兩種生物型稗草對莠去津產(chǎn)生抗性原因之一。

本研究僅從代謝抗性和抗氧化酶系活性方面初步研究抗性產(chǎn)生機理，但抗性產(chǎn)生是否涉及其他酶系作用，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

a.本研究采用室內(nèi)瓊脂法與整株盆栽法檢測稗草對三種除草劑抗藥性，檢測抗性水平結(jié)果基本一致，因此可利用瓊脂法快速篩選稗草三種除草劑抗性生物型，再以整株盆栽法進一步驗證。

b.黑龍江省12個地區(qū)玉米田稗草生物型中，賓縣生物型對莠去津產(chǎn)生低水平抗性，雞西和五常生物型屬于敏感性下降階段；12個稗草生物型均未對乙草胺和硝磺草酮產(chǎn)生抗性。

c.稗草體內(nèi)GSTs和POD酶活性變化率與莠去津抗性呈正相關(guān)；SOD和CAT酶活性變化無規(guī)律，與莠去津抗性無關(guān)。賓縣（R）和五常（M）兩種生物型稗草可能對莠去津產(chǎn)生基于代謝能力增強的非靶標抗性。

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