PRR11對(duì)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響

宋宗昌，郭春亮，唐家宏，朱 璐，申品穎，張 紅，韓懷忠，趙鵬飛

解放軍第一五五中心醫(yī)院腫瘤科/開(kāi)封市血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475003

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是肝臟第二常見(jiàn)原發(fā)惡性腫瘤，約占全部肝臟原發(fā)腫瘤的10%，多數(shù)患者預(yù)后很差[1-2]。近年來(lái)，ICC發(fā)病率和死亡率有逐漸增高的趨勢(shì)，我國(guó)ICC的發(fā)病率占全球的一半以上 。ICC的治療方法仍以手術(shù)切除為主，由于我國(guó)人民的健康意識(shí)淡薄，常規(guī)體檢及腫瘤篩查工作相對(duì)落后，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，多數(shù)無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，然而進(jìn)行R0切除的患者5年生存期為20%～40%,術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)75%[3]。ICC的發(fā)病機(jī)制及其發(fā)展的重要影響因素尚不明確，探索研究與ICC發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要分子及相關(guān)機(jī)制有望為其預(yù)后判斷及臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11, PRR11)基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有癌基因潛能的基因，位于人類染色體17q22區(qū)[4]。文獻(xiàn)[5]報(bào)道，PRR11在一些腫瘤組織，如食管癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌及肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，而在其相應(yīng)癌旁組織中低表達(dá)，是患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素之一。PRR11與ICC的關(guān)系尚不明確，對(duì)ICC病理特征及患者臨床預(yù)后的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)組織芯片及免疫組化方法檢測(cè)PRR11在ICC及其癌旁組織中的表達(dá)情況，并探討其對(duì)ICC臨床病理特征的影響及其與ICC患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2003年1月至2008年12月在解放軍第一五五中心醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)病理確診為ICC的67例患者資料，包括癌組織石蠟標(biāo)本、相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊界>2 cm，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌組織)石蠟標(biāo)本、臨床病理特征及隨訪資料(包括年齡、性別、T分期、N分期、TNM分期、分化程度及生存狀況)。所有患者術(shù)前、術(shù)后均未行放、化療。隨訪日期截止到2013年12月。所有組織標(biāo)本的獲得均得到患者的同意，簽訂知情同意書，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)許可。

1.2試劑和方法所有患者組織HE染色玻片均經(jīng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家鑒定并確診為ICC。根據(jù)報(bào)道方法[6]進(jìn)行組織微陣列構(gòu)建。從供體蠟塊取出1 mm組織柱，放入受體石蠟塊中，加熱融合。4 μm厚度連續(xù)切片貼到3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)預(yù)處理的玻片上。S-P法染色：經(jīng)過(guò)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活及I抗孵育、Ⅱ抗結(jié)合、顯色等過(guò)程。抗體稀釋按下列方式進(jìn)行：兔抗人多克隆PRR11抗體(1∶100稀釋；美國(guó)Sigma-Aldrich公司，HPA023923)，免疫組化染色S-P試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；KIT-9710)顯色。蘇木素進(jìn)行復(fù)染。

1.3結(jié)果判定PRR11蛋白免疫組化染色結(jié)果由2位病理科專家分別在奧林帕斯CX31顯微鏡下觀察(日本Olympus公司)。免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]采用免疫顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞密度相結(jié)合的方法綜合計(jì)算：細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)染色，1分為弱染色(淡黃色細(xì)顆粒)，2分為中染色(棕黃色顆粒)，3分為強(qiáng)染色(褐黃色粗顆粒)。腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分：0分為0，1分為0～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為75%～100%。計(jì)算公式：兩者相乘≤3分為陰性，≥4分為陽(yáng)性。每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野(400×)，取其均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ICC組織與癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)差異分析、PRR11蛋白表達(dá)與ICC臨床病理相關(guān)性分析均采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法對(duì)生存曲線進(jìn)行描述，并對(duì)PRR11蛋白表達(dá)陽(yáng)性及陰性患者的生存差異進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PRR11蛋白表達(dá)情況67例ICC組織中有39例PRR11蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為58.2%，ICC組織中PRR11蛋白表達(dá)評(píng)分為7.15±3.58；癌旁組織中有8例PRR11蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.9%，癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)評(píng)分為2.28±1.27。ICC組織與癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 PRR11在ICC組織及癌旁組織中的表達(dá)(400×) A:癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)陽(yáng)性; B：癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)陰性；C：ICC組織中PRR11蛋白表達(dá)陽(yáng)性；D：ICC組織中PRR11蛋白表達(dá)陰性Fig 1 PRR11 expressions in ICC tissues and adjacent tissues (400×) A: positive expression of PRR11 in adjacent tissues; B: negative expression of PRR11 in adjacent tissues; C: positive expression of PRR11 in ICC tissues; D: negative expression of PRR11 in ICC tissues

2.2PRR11蛋白表達(dá)與ICC臨床病理特征的相關(guān)性分析PRR11蛋白表達(dá)陽(yáng)性與癌組織的局部浸潤(rùn)程度(P=0.001)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及TNM分期(P=0.009)有顯著相關(guān)性；而與患者年齡(P=0.085)、性別(P=0.052)及癌組織分化程度(P=0.530)無(wú)明顯相關(guān)性(見(jiàn)表1)。

2.3生存分析利用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，67例ICC患者的中位生存時(shí)間為29.4個(gè)月，PRR11蛋白陰性表達(dá)的ICC患者中位生存時(shí)間為41.0個(gè)月，PRR11蛋白陽(yáng)性表達(dá)的ICC患者中位生存時(shí)間為20.3個(gè)月(見(jiàn)圖2)。PRR11蛋白陽(yáng)性表達(dá)的ICC患者的預(yù)后明顯低于陰性表達(dá)患者(P=0.002)。

3 討論

ICC是指原發(fā)于肝內(nèi)膽管上皮的惡性腫瘤，占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%～15%，占膽管癌的5%～10%[8-9]?；谏L(zhǎng)模式大體標(biāo)本分為3種類型：腫塊型、管周浸潤(rùn)型及管內(nèi)生長(zhǎng)型[10]。組織病理類型分為：腺癌、鱗癌、腺鱗癌、黏液表皮樣癌、未分化癌及類癌等，其中腺癌超過(guò)90%[11]。近年來(lái)，ICC發(fā)病率和死亡率有逐漸升高的趨勢(shì)。美國(guó)每年新發(fā)病例約8 000人，我國(guó)沒(méi)有系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)資料，據(jù)文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道，我國(guó)ICC的發(fā)病率約占全球的55%。目前，ICC治療仍以手術(shù)切除為主，根治性手術(shù)切除后5年生存率為8%～47%；行姑息性切除者，3年生存率為11%，5年生存率為0；其他治療或未治療者平均生存期為4～6個(gè)月[12-14]。ICC早期無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者在診斷時(shí)已失去了手術(shù)根治的時(shí)機(jī)，即使予以放療、化療、分子靶向藥物及最佳支持治療等，總體5年存活率仍低于5%[3]。

表1 PRR11蛋白表達(dá)與ICC患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation between expression of PRR11 and clinical pathology feature of ICC patients 比例/%

圖2 PRR11蛋白表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)性分析Fig 2 Analysis of correlation between expression of PRR11 and survival time

PRR11基因位于人類染色體17q22區(qū)，含有51 211個(gè)堿基，包括9個(gè)內(nèi)含子及10個(gè)外顯子，PRR11蛋白由360個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，相對(duì)分子量約40 kD[15-16]，包含1個(gè)二聯(lián)核定位信號(hào)，2個(gè)脯氨酸富集區(qū)域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc finger domain, ZFD)。該蛋白的作用靶標(biāo)可能為膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子等與腫瘤產(chǎn)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白及基因位點(diǎn)。文獻(xiàn)[5]報(bào)道，PRR11在一些腫瘤組織如食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌等組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)，是腫瘤預(yù)后不良的因素。

為進(jìn)一步了解PRR11蛋白表達(dá)與ICC的關(guān)系，我們收集了67例ICC患者的癌組織標(biāo)本、癌旁組織標(biāo)本、相關(guān)病理參數(shù)資料及相應(yīng)的臨床隨訪資料，研究了PRR11蛋白在ICC組織及癌旁組織中表達(dá)的差異、PRR11蛋白表達(dá)與ICC病理參數(shù)之間的關(guān)系，及其對(duì)ICC患者預(yù)后的影響。利用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRR11蛋白在ICC組織中高表達(dá)(39例，58.2%)，而在正常癌旁組織中低表達(dá)(8例，11.9%)，PRR11蛋白表達(dá)上調(diào)和ICC患者年齡、性別、癌組織分化程度無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤局部浸潤(rùn)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有顯著相關(guān)性。我們利用隨訪資料進(jìn)行Kaplan-Meier方法生存分析顯示，PRR11蛋白高表達(dá)ICC患者較PRR11蛋白低表達(dá)患者的總生存期短。

上述研究結(jié)果說(shuō)明，PRR11蛋白在ICC組織中高表達(dá)，并與癌細(xì)胞局部浸潤(rùn)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等病理特征顯著相關(guān)，PRR11蛋白高表達(dá)ICC患者生存期顯著短于PRR11蛋白低表達(dá)患者。提示PRR11蛋白高表達(dá)可能是ICC患者的獨(dú)立預(yù)后因素及ICC進(jìn)展的標(biāo)志物，檢測(cè)其表達(dá)水平對(duì)于判斷ICC患者的預(yù)后具有重要的臨床實(shí)踐意義，為靶向ICC中PRR11基因表達(dá)過(guò)程的治療提供理論基礎(chǔ)。

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