慢病毒介導(dǎo)的脯氨酰寡肽酶過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞功能的影響

周 達(dá)， 王 晶， 何玲楠， 李夢(mèng)婷， 孫 超， 陳源文， 范建高

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200092

脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase，POP，EC 3.4.21.26)是一種能特異性水解短肽中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，在體內(nèi)發(fā)揮重要生理功能，參與多肽的生成與代謝、調(diào)控細(xì)胞增殖與分化、調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥代謝等[1-3]；但是，POP在外周組織中的具體生物學(xué)作用仍未知。肝臟中POP活性很高，提示其在肝內(nèi)生物學(xué)功能值得探索[4-6]。同時(shí)已有研究[7]發(fā)現(xiàn)，POP參與肝內(nèi)炎癥及肝細(xì)胞增殖與分化。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，POP水解胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)產(chǎn)物N-乙?；?絲氨酸-天冬氨酸-賴氨酸-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)具有抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)活性和抗肝纖維化作用[8-9]；其他研究人員發(fā)現(xiàn)，Tβ4對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)急性肝毒性有保護(hù)作用同時(shí)可以抑制HSC活性[10-11]。然而，POP在HSC內(nèi)具體功能尚不明確。

肝纖維化主要表現(xiàn)肝內(nèi)炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，HSC起至關(guān)重要的作用[12-13]。本研究旨在以HSC作為切入點(diǎn)，通過(guò)攜帶POP基因的慢病毒感染HSC-T6，探討POP在HSC內(nèi)的生物學(xué)功能，進(jìn)一步闡明POP在肝臟炎癥與纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。HSC-T6根據(jù)需要以適當(dāng)密度接種于不同大小培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS/DMEM培養(yǎng)基(血清及培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco，USA)，置于含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中，在細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)進(jìn)行下述相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2攜帶POP基因的慢病毒感染HSC通過(guò)PubMed搜索大鼠POP基因(Prep，NM_031324)，設(shè)計(jì)攜帶POP和綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒(POP-virus)及空載病毒(Mock-virus)，并由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成；選取不同的病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI值)1、10、100進(jìn)行感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡下觀察感染效率，最終將MOI確定為10；接種一定數(shù)量HSC-T6至3.5 cm培養(yǎng)皿24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，隨后參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行感染操作，加入慢病毒或空病毒感染12 h后換液為質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS/DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h(根據(jù)細(xì)胞密度決定)，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組，熒光顯微鏡下觀察感染效率，隨后進(jìn)行各組細(xì)胞RNA及蛋白提取及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3ELISA檢測(cè)對(duì)POP慢病毒組、空病毒組及正常對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ac-SDKP測(cè)定，采用ELISA測(cè)定方法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)(購(gòu)自SPI Bio and CEA，F(xiàn)rance)進(jìn)行。Ac-SDKP的終濃度通過(guò)各組細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行校正，計(jì)算出每106個(gè)細(xì)胞中Ac-SDKP的量，以(nmol/L)/106表示。

1.4CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)將POP慢病毒、空病毒及正常的HSC-T6以相同數(shù)量接種于96孔板中共培養(yǎng)24 h 和48 h，每孔加入200 μl培養(yǎng)液，每孔加入100 μl新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，再加入10 μl CCK-8試劑，避光37 ℃孵育2 h，隨后通過(guò)酶標(biāo)儀(uQuant，Biotek，USA)測(cè)定每孔在450 nm處吸光度值(OD值)。各孔OD值均需先減去空白孔OD值后分析各組HSC-T6的增殖生長(zhǎng)差異。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)將感染慢病毒、空病毒及正常的HSC-T6以相同數(shù)量接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，使用不含EDTA的胰酶(購(gòu)自GIBCO，USA)消化提取細(xì)胞，然后通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)HSC-T6凋亡，具體步驟參照Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒(Becton-Dickinson，USA)。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)POP慢病毒組、空病毒組及正常對(duì)照組進(jìn)行HSC細(xì)胞內(nèi)RNA提取，采用Trizol法(Trizol購(gòu)自Takara)測(cè)定各組提取的RNA濃度及純度，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(primescriptRTmaster mix購(gòu)自Takara)，進(jìn)而利用cDNA進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)定量PCR(SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自Takara，儀器為Biosystems 7500 Real-time PCR system)檢測(cè)POP、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、Ⅰ型膠原(Col I)相關(guān)基因mRNA表達(dá)量，各基因設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(見(jiàn)表1)，最終結(jié)果使用相對(duì)表達(dá)量RQ值(2-ΔΔCt)表示，具體操作步驟參考實(shí)際說(shuō)明書(shū)。

1.7Westernblotting檢測(cè)提取POP慢病毒組、空病毒組及正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)蛋白，采用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度(BCA試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司)。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的BSA封閉2 h，各相關(guān)蛋白一抗孵育(4 ℃過(guò)夜)，1×TBST洗膜10～15 min×3次，二抗孵育1～2 h，1×TBST洗膜10～15 min×3次，最后使用辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)(購(gòu)自Millipore Corporation，Billerica，USA)，使用Image Lab分析蛋白顯影條帶。POP、TGF-β1、α-SMA三者抗體均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，p-Smad2/3抗體購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司，Smad7、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，相關(guān)二抗及Western blotting相關(guān)其他試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，具體步驟參考相關(guān)試劑說(shuō)明書(shū)。

表1 Real-time-PCR引物序列Tab 1 Sequence of primers of Real-time-PCR

注：*:Prep為POP的基因名稱。

2 結(jié)果

2.1慢病毒感染效率48～72 h后進(jìn)行熒光顯微鏡下GFP檢測(cè)，慢病毒及空病毒感染效率均95%以上(見(jiàn)圖1A)，為進(jìn)一步檢測(cè)病毒感染HSC效率，檢測(cè)HSC內(nèi)POP的基因及蛋白表達(dá)量，慢病毒組POP mRNA和蛋白表達(dá)較空病毒組及正常對(duì)照組顯著升高(見(jiàn)圖1B～1C)。

2.2POP慢病毒感染對(duì)HSC內(nèi)Ac-SDKP水平的影響POP慢病毒組細(xì)胞內(nèi)Ac-SDKP較正常對(duì)照組及空病毒組顯著升高約50%(P<0.05)，空病毒組與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2A)。

注：con：正常對(duì)照組;mock：空病毒組;prep：POP慢病毒組。*P<0.05;**P<0.01。

CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，慢病毒組細(xì)胞在24 h及48 h均較正常對(duì)照組增殖生長(zhǎng)快，在48 h時(shí)較空病毒組多增殖約50%，而空病毒組與正常對(duì)照組細(xì)胞增殖比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2B)。不同組別HSC-T6相同條件下培養(yǎng)24 h后，HSC-T6凋亡比例雖較其他兩組稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2C)。

2.4POP慢病毒感染對(duì)細(xì)胞炎癥與纖維化基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響POP慢病毒組MCP-1及α-SMA mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著下降，TGF-β1和Col I mRNA表達(dá)各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。POP病毒組α-SMA蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)，而Smad7、PPAR-γ蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著上調(diào)，TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

注：con：正常對(duì)照組；mock;空病毒組；prep;POP慢病毒組。*P<0.05，**P<0.01，NS：無(wú)差異。

注：con：正常對(duì)照組；mock：空病毒組；prep：POP慢病毒組。*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究利用攜帶POP基因的慢病毒感染HSC，發(fā)現(xiàn)POP可抑制HSC分泌炎性因子MCP-1及α-SMA的表達(dá)，并可能通過(guò)上調(diào)Smad7、PPAR-γ的表達(dá)抑制HSC的活化，從而具有抗纖維化的作用。

從HSC-T6表達(dá)熒光蛋白、胞內(nèi)POP基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均提示POP慢病毒感染成功，且在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)POP；同時(shí)測(cè)定各組HSC-T6胞內(nèi)Ac-SDKP水平變化，提示細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的POP存在活性；Ac-SDKP為POP水解Tβ4的產(chǎn)物[14]，具有抗多種器官纖維化作用[8-9,15-16]。本課題組[9]在前期工作中已探索Ac-SDKP抗CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的機(jī)制，主要為抑制TGF-β1和p-Smad2/3的表達(dá)，同時(shí)抑制HSC的增殖生長(zhǎng)，對(duì)Smad7表達(dá)無(wú)影響。本研究發(fā)現(xiàn)，POP對(duì)TGF-β1和p-Samd2/3表達(dá)無(wú)影響，而是促進(jìn)Smad7表達(dá)，而Smad7為T(mén)GF-Smad信號(hào)通路抑制蛋白，具有抗纖維化作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，POP明顯促進(jìn)HSC-T6的增殖，與Ac-SDKP作用相反；通過(guò)本研究可以推斷水解酶活性僅是POP一小部分功能，POP更重要的功能在于與其他蛋白結(jié)合的協(xié)同作用，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞生長(zhǎng)，這種非酶解功能在中樞系統(tǒng)中研究較多[17-19]，在肝臟系統(tǒng)中研究甚少，值得我們進(jìn)一步深入研究。此外，POP抑制α-SMA和MCP-1的表達(dá)，α-SMA為活化HSC的標(biāo)志，MCP-1為HSC分泌的主要促炎促纖維化因子[20]，與前期Ac-SDKP作用結(jié)果一致。值得一提的是，POP與其下游產(chǎn)物Ac-SDKP在抗肝纖維化效應(yīng)的具體作用仍不能完全區(qū)分，目前缺乏有效方法可以將Ac-SDKP抑制。

我們還發(fā)現(xiàn)，POP的HSC-T6胞內(nèi)PPAR-γ表達(dá)顯著升高，后者最早被認(rèn)為是重要成脂基因之一[21]，后越來(lái)越多證據(jù)證實(shí)其為HSC活化和表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，在維持HSC保持靜止?fàn)顟B(tài)發(fā)揮重要作用，可以抑制α-SMA和TGF-β1等表達(dá)，是抑制肝臟炎癥纖維化重要因子[22-23]。另有研究[24-26]發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可以阻斷TGF-β信號(hào)通路及抑制Smad蛋白依賴的啟動(dòng)子發(fā)揮作用，直接拮抗Smad3在成纖維細(xì)胞中的作用，但是不減少Smad3的蛋白表達(dá)也不增加Smad7的表達(dá)。HSC另外一個(gè)特點(diǎn)是儲(chǔ)存維生素A類物質(zhì)，隨著其活化，這種物質(zhì)會(huì)逐漸減少直至消失，盡管這種現(xiàn)象與HSC活化、疾病進(jìn)展關(guān)系未完全闡明[27-29]。PPAR-γ可以使HSC恢復(fù)這種聚類維生素A物質(zhì)功能，同時(shí)減輕胰島素抵抗、脂肪性肝炎[23]，同時(shí)我們課題組在近期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，POP通過(guò)調(diào)控肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝合成基因抑制肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝[30]；進(jìn)一步結(jié)合前面所述POP與HSC增殖的關(guān)系，表面上POP促進(jìn)HSC的增殖可促進(jìn)纖維化進(jìn)展，但POP促進(jìn)HSC增殖的同時(shí)也使其從活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止儲(chǔ)脂狀態(tài)，進(jìn)一步抑制其促纖維化活性[31]。因此，我們推斷POP在脂肪性肝炎及其所致纖維化方面也存在重要作用，同時(shí)調(diào)控HSC活性。

注：con:正常對(duì)照組；mock組別:空病毒組；prep:POP慢病毒組。*P<0.05,**P<0.01，NS：無(wú)差異。

總之，本研究證實(shí)了POP蛋白酶在HSC中生物學(xué)功能顯著，反映其可能具備肝內(nèi)抗炎、抗纖維化作用，仍需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是肝臟系統(tǒng)復(fù)雜，本研究?jī)H針對(duì)HSC，POP肝內(nèi)具體功能仍存在許多未解之謎，尤其它的非酶解功能，值得進(jìn)一步深入挖掘探索，可能為肝臟疾病提供新的診療切入點(diǎn)。

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