3種小鼠肝纖維化模型的建立及評(píng)價(jià)

魯智文， 潘曉莉， 宋宇虎

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430022

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)[1]，絕大多數(shù)的肝硬化和肝癌患者由肝纖維化發(fā)展而來[2]，肝纖維化屬于可逆性病變，因此，建立一種合適的肝纖維化動(dòng)物模型對(duì)于研究肝纖維化的發(fā)生發(fā)展、防治肝硬化和肝癌具有重要意義[3]。本研究旨在建立3種不同機(jī)制的小鼠肝纖維化模型，為肝纖維化的研究提供合適的動(dòng)物模型。

1 材料與方法1.1 材料

SPF級(jí)C57/BL6小鼠雄性41只，雌性3只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。硫代乙酰胺(TAA)及二乙基亞硝胺(DEN)購自日本TCI公司，四氯化碳(CCl4)購自武漢啟動(dòng)子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽總管結(jié)扎(bile duct ligation, BDL)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型：隨機(jī)選取20只小鼠分為2組，模型組15只，用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，開腹后游離膽總管進(jìn)行雙重結(jié)扎并離斷，縫合腹腔；對(duì)照組5只，為假手術(shù)組，麻醉開腹后將膽總管游離，縫合腹腔。于4周后處死小鼠。

1.2.2 TAA誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型：將另20只小鼠分為2組，模型組15只,將150 mg TAA溶于10 ml生理鹽水中配成15 mg/ml的溶液，以150 mg/kg的劑量腹腔注射，每周3次，連續(xù)8周，并分別于第2周、3周、4周、6周、8周時(shí)隨機(jī)處死小鼠2只；對(duì)照組5只，腹腔注射生理鹽水。

1.2.3 DEN+CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型：將1雄3雌4只小鼠飼養(yǎng)至10周后合籠，將孕鼠單獨(dú)分籠，繁殖的小鼠隨機(jī)分為模型組15只，15 d大的小鼠以25 mg/kg的劑量腹腔注射DEN 1次，29 d時(shí)第1次注射質(zhì)量濃度為100 g/L的CCl4，5 ml/kg，此后每周注射1次，分別于注射的第10周、12周、14周、16周、18周、20周時(shí)隨機(jī)處死模型組動(dòng)物2只;對(duì)照組5只,腹腔注射生理鹽水。各組小鼠處死后取肝組織做石蠟包埋及切片,行HE染色及天狼猩紅染色，用光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果2.1 肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

所有模型的正常對(duì)照組小鼠均可見正常肝小葉，無炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。

2.1.1 BDL模型組：第4周時(shí)匯管區(qū)可見大量小葉間膽管增生及纖維組織增生，形成匯管區(qū)-匯管區(qū)橋接纖維化，且肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見片狀肝細(xì)胞壞死(見圖1)。

2.1.2 TAA模型組：第2周時(shí)肝小葉形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)散在炎性細(xì)胞浸潤；第3周時(shí)開始出現(xiàn)肝臟纖維組織增生，可見少許纖維間隔，并廣泛肝細(xì)胞水樣變；第4周時(shí)纖維間隔增加，并廣泛肝細(xì)胞水樣變；第6周時(shí)小葉結(jié)構(gòu)略紊亂，形成橋接纖維化，不完全假小葉形成；第8周時(shí)小葉結(jié)構(gòu)紊亂，大量纖維間隔形成，肝硬化更為典型(見圖2)。

圖1 BDL組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果(100×)

圖2 TAA組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果(100×)Fig 2 Results of histopathological examination of liver tissue in TAA group (100×)

2.1.3 DEN+CCl4模型組：第10周時(shí)假小葉已基本形成；第12周時(shí)形成完整的假小葉，肝硬化較為典型；第14周時(shí)大體標(biāo)本可見肝硬化結(jié)節(jié)形成；第16周時(shí)形成肝癌，HE可見正常肝臟結(jié)構(gòu)已被腫瘤組織浸潤、破壞，細(xì)胞呈巢狀排列；多數(shù)癌細(xì)胞體積大，呈多角形，胞漿豐富，核大深染，可見病理核分裂象，殘存肝組織被腫瘤壓迫。第18周及20周時(shí)肝癌表現(xiàn)更加明顯(見圖3)。

圖3 DEN+CCl4組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果(100×)Fig 3 Results of histopathological examination of liver tissue in DEN+CCl4 group (100×)

2.2 肝纖維化造模死亡率統(tǒng)計(jì)

2.2.1 BDL組：模型組15只小鼠在術(shù)后1～3 d死亡6只，術(shù)后1周死亡2只，術(shù)后2周死亡2只，死亡率為66.7%；對(duì)照組小鼠術(shù)后1 d死亡1只。分析死亡原因可能為BDL引起的急性肝損傷及手術(shù)不耐受所致。

2.2.2 TAA組：模型組15只小鼠在第1次腹腔注射藥物后死亡3只，此后再無小鼠死亡，死亡率為20.0%，分析可能為TAA引起的急性肝損傷，小鼠不耐受所致；對(duì)照組無小鼠死亡。

2.2.3 DEN+CCl4組：模型組無小鼠死亡，存活率為100%。對(duì)照組無小鼠死亡。

3 討論

各種病因?qū)е赂闻K受損，使肝細(xì)胞發(fā)生壞死、再生，肝臟中纖維組織增生、肝纖維化形成，可進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化及肝癌[4]。肝臟在損傷后發(fā)生修復(fù)時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，導(dǎo)致膠原沉積，纖維結(jié)締組織增生，即為肝纖維化，病情繼續(xù)發(fā)展，則纖維間隔形成，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，代之以假小葉，則形成肝硬化，最后可導(dǎo)致肝癌產(chǎn)生[2]。

3種模型誘導(dǎo)肝纖維化產(chǎn)生機(jī)制：(1)BDL模型：BDL模型的原理與人的繼發(fā)性膽源性肝硬化的機(jī)制相似，通過形成肝外膽道梗阻，從而引起膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力升高，并可發(fā)生肝內(nèi)膽小管擴(kuò)張破裂，肝內(nèi)血管受擴(kuò)張膽管及膽汁外滲的雙重壓迫，使肝細(xì)胞缺血壞死，纖維組織大量增生，包圍肝小葉，最終形成肝硬化[5]。(2)TAA模型：TAA是一種典型的小鼠肝纖維化及肝硬化模型，采用TAA誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型在血流動(dòng)力學(xué)、形態(tài)學(xué)及生化代謝改變等方面均與人肝纖維化極其相似，與病毒性誘發(fā)的肝硬化也很相似。TAA可作用在肝細(xì)胞DNA、RNA和蛋白合成酶上產(chǎn)生毒性作用，還可誘發(fā)肝代謝紊亂，甚至導(dǎo)致肝壞死[6]。前人在造模方法上各有不同，我們?cè)诳偨Y(jié)前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行探索，成功建立了小鼠肝纖維化及肝硬化模型，該模型具有造模周期短(3～6周即可成模)，操作簡便，且與口服藥物相比，腹腔注射可控制給藥劑量，減少個(gè)體差異，具有較好的重復(fù)性。但TAA藥物毒性大，且易揮發(fā)，易造成環(huán)境污染，操作時(shí)需在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，注意個(gè)人防護(hù)。(3)DEN+CCl4模型：DEN中含有的亞硝胺基團(tuán)具有很強(qiáng)的中毒劑和誘癌劑的雙重作用[7]，文獻(xiàn)中多用來誘導(dǎo)小鼠肝癌模型，與人類肝細(xì)胞癌較為相似[8]，本實(shí)驗(yàn)利用DEN的致癌作用，聯(lián)合CCl4，CCl4導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型肝損傷的最主要原因是氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。通過控制CCl4的給藥次數(shù)，成功建立了小鼠肝硬化及肝癌模型，減少了DEN的給藥，大大降低了死亡率，重復(fù)性好，拓展了小鼠肝硬化模型的構(gòu)建方式。

本實(shí)驗(yàn)中肝臟組織HE染色及天狼猩紅染色可見BDL組第4周時(shí)大量纖維組織增生，膽小管大量擴(kuò)張、增殖，出現(xiàn)假小葉；TAA組第2周時(shí)即有明顯的肝臟損傷，少量纖維組織增生，第3周可見大量炎性細(xì)胞浸潤，少量纖維組織增生，第4周時(shí)假小葉基本形成，第6周及8周時(shí)肝纖維化更為典型；DEN+CCl4組小鼠第10周時(shí)假小葉已基本形成，第12周時(shí)出現(xiàn)典型的肝硬化表現(xiàn)，第16周時(shí)癌變發(fā)生，可見病理核分裂象，第18周及20周時(shí)癌變更為明顯。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了3種不同機(jī)制的小鼠肝纖維化模型，不同模型的肝纖維化程度及特點(diǎn)不同，在具體的研究工作中，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型，以達(dá)到最佳的實(shí)驗(yàn)效果。

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