瑞香狼毒涂搽劑急性毒性及對(duì)皮膚刺激性試驗(yàn)

李 鋒 ，裴 樂(lè) ，劉秀麗 ，盧 巖 ，范金林 ，楊寶龍 ，喬健敏 ，侯勇躍

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市賽罕區(qū)農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 呼和浩特010020）

瑞香狼毒系瑞香科狼毒屬植物，廣泛分布于我國(guó)西北、西南、華北等地，其根是傳統(tǒng)中藥——狼毒的基質(zhì)，國(guó)內(nèi)外調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)其具有殺蟲(chóng)、抗癌或抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗驚厥、提高免疫系統(tǒng)等多種作用。秦寶福等［1］用瑞香狼毒根不同溶劑提取物對(duì)7種供試病原真菌的抑制作用進(jìn)行了研究，分析認(rèn)為，狼毒根中含有中等極性和強(qiáng)極性的強(qiáng)殺菌物質(zhì)，并推斷狼毒根中可能含有抑菌活性物質(zhì)的增效物或不同抑菌物之間存在協(xié)同促進(jìn)作用；龔曉霞等［2］經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究表明，瑞香狼毒提取物對(duì)病原真菌石膏樣毛癬菌有較強(qiáng)的抑制作用；姜翠寶等［3］研究證實(shí)，瑞香狼毒提取物對(duì)家兔毛癬病具有良好的治療效果；鄧孝廷等［4］用自制的瑞香狼毒涂搽劑治療獺兔皮膚真菌病總有效率達(dá)92.32%。這些研究均充分說(shuō)明瑞香狼毒具有抗菌藥用價(jià)值。

內(nèi)蒙古現(xiàn)有天然草場(chǎng)0.87億hm2，而有瑞香狼毒生長(zhǎng)的草場(chǎng)面積已達(dá)200多萬(wàn)hm2，且瑞香狼毒草場(chǎng)的面積每年還以14.67萬(wàn)hm2速度向前推進(jìn)，急待開(kāi)發(fā)治理［5］，因此，開(kāi)展以現(xiàn)代藥學(xué)研究為基礎(chǔ)的瑞香狼毒有效活性成分提取方法及藥物特性試驗(yàn)，不僅可以發(fā)揮瑞香狼毒藥用價(jià)值高的特點(diǎn)，同時(shí)還可起到保護(hù)草原、變害為寶的作用。內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所獸藥與獸醫(yī)生物制品課題組已于2013年開(kāi)始對(duì)瑞香狼毒展開(kāi)了預(yù)防與治療皮膚癬菌病的瑞香狼毒涂搽劑的研究。為了進(jìn)一步確定瑞香狼毒的毒性及使用安全性，該試驗(yàn)對(duì)瑞香狼毒涂搽劑進(jìn)行了急性經(jīng)口毒性和皮膚刺激性研究，旨在為瑞香狼毒涂搽劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑：瑞香狼毒涂搽劑棕紅色透明液體，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所獸用藥物實(shí)驗(yàn)室制取。

供試動(dòng)物：健康小白鼠14只，雌雄各半，體重21.5～22.5 g；健康大白兔12只，雌雄各半，體重1.5～3.0 kg，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：采用寇氏法選擇體重21.5～22.5 g的健康小白鼠分成3組（每組3只，雌雄隨機(jī)）供試，另取4只完成補(bǔ)充試驗(yàn)，瑞香狼毒涂搽劑用無(wú)菌超純水稀釋到10、100、1 000 mg/kg后對(duì)小白鼠進(jìn)行灌胃（分為低劑量組、中劑量組、高劑量組），并設(shè)置無(wú)菌超純水為對(duì)照組（只灌喂超純無(wú)菌水）。灌胃前讓小白鼠隔夜禁食但不禁水，稱重后，將藥液按照小白鼠的分組進(jìn)行灌喂，3～5 h后才可進(jìn)食，根據(jù)24 h死亡情況再進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，觀察記錄小白鼠的中毒表現(xiàn)及死亡時(shí)間。

該試驗(yàn)共設(shè)計(jì)了10種小白鼠死亡情況（見(jiàn)表1），并根據(jù)其死亡情況進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)（見(jiàn)表2）。

表1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)小白鼠死亡情況設(shè)計(jì)

表2 補(bǔ)充試驗(yàn)

1.2.2 急性皮膚刺激試驗(yàn)

1.2.2.1 單次皮膚刺激性試驗(yàn)：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15670—1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》的操作規(guī)程進(jìn)行相關(guān)操作。分組：受試大白兔隨機(jī)分為4組，每組2只，在試驗(yàn)前用脫毛器對(duì)其背部?jī)蓚?cè)進(jìn)行6 cm×6 cm區(qū)域的去毛。分區(qū)：將大白兔背部左側(cè)定為試驗(yàn)區(qū)，右側(cè)定為對(duì)照區(qū)，每側(cè)又分為前后2個(gè)區(qū)，后面為破損皮膚試驗(yàn)區(qū)，前面為完整皮膚試驗(yàn)區(qū)。試驗(yàn)操作：完整皮膚試驗(yàn)區(qū)用記號(hào)筆標(biāo)記，6 cm×6 cm區(qū)域；破損皮膚試驗(yàn)區(qū)用手術(shù)刀劃“井”字破口，破損區(qū)面積6 cm×6 cm，劃痕間距2 cm，以輕度滲血不傷及真皮為度。左側(cè)每個(gè)受試區(qū)每組給予瑞香狼毒涂搽劑0.5 mL，使用前搖勻，用棉棒涂抹面積6 cm×6 cm，涂抹后加2層紗布覆蓋保護(hù)。每只大白兔均單獨(dú)籠子飼養(yǎng)。24 h后用紗布蘸上25～35℃的蒸餾水擦除瑞香狼涂搽劑，分別在去除受試物后 10 min、30 min、1 h、2 h、24 h、48 h、72 h觀察涂敷部位有無(wú)紅斑和水腫情況，以及皮膚變化的恢復(fù)時(shí)間、情況等。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15670—1995對(duì)皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，進(jìn)行處理分析。

1.2.2.2 多次皮膚刺激性試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為單次皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每日涂抹藥量仍然為0.5 mL，24 h后用紗布蘸上25～35℃的蒸餾水擦除瑞香狼涂搽劑，然后觀察病變，連續(xù)涂抹10 d。每次涂抹前除去絨毛，每次涂抹后24 h觀察結(jié)果，記錄每天的紅斑及水腫情況，并仔細(xì)檢查涂抹部位是否有出血點(diǎn)、皮膚粗糙等情況與發(fā)生及消退時(shí)間。然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行積分處理。

1.2.3 眼刺激試驗(yàn)：另選眼睛無(wú)異常的健康大白兔4只，雌雄各半，選其左眼為對(duì)照，右眼滴瑞香狼毒涂搽劑0.1 mL/只，用藥后24 h內(nèi)不清洗。滴藥后在 0、1、3、24、48、72 h，分別觀察大白兔眼睛，記錄其變化。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》中“眼損傷程度評(píng)分”及“眼刺激分級(jí)”計(jì)算分值與判斷刺激強(qiáng)度。

表3 瑞香狼毒涂搽劑各劑量組小白鼠死亡情況

圖1 破損皮膚試驗(yàn)區(qū)無(wú)菌超純水涂抹1次后的效果

圖2 破損皮膚試驗(yàn)區(qū)無(wú)菌超純水涂抹多次后的效果

圖3 破損皮膚試驗(yàn)區(qū)瑞香狼毒涂搽劑涂抹1次后的效果

圖4 破損皮膚試驗(yàn)區(qū)瑞香狼毒涂搽劑涂抹多次后的效果

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 藥劑給予小白鼠后，高劑量組 （1 000 mg/kg）小白鼠及早出現(xiàn)了中毒癥狀，表現(xiàn)為煩躁不安、抽搐、掙扎直至死亡，低劑量組（10 mg/kg）與中劑量組（100 mg/kg）的小白鼠中毒表現(xiàn)不明顯。小白鼠死亡發(fā)生在10 h內(nèi)，存活的小白鼠24 h后逐漸恢復(fù)正常，各劑量組動(dòng)物死亡情況見(jiàn)表3。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，瑞香狼毒涂搽劑急性經(jīng)口毒性的LD50為894.4 mg/kg，大于500 mg/kg。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15670—1995，初步判定瑞香狼毒涂搽劑的急性經(jīng)口毒性屬于低毒級(jí)。

2.2 急性皮膚刺激試驗(yàn)

去除瑞香狼毒涂搽劑后 10 min、30 min、1 h、2 h、24 h、48 h、72 h 觀察大白兔皮膚紅斑及水腫情況，到72 h時(shí)大白兔皮膚沒(méi)有出現(xiàn)紅斑和水腫的現(xiàn)象，微紅染，局部無(wú)隆起、無(wú)水腫（30 min及72 h觀察情況見(jiàn)圖1～圖6）。單次與多次給藥的皮膚刺激性試驗(yàn)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15670—1995對(duì)皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每一觀察時(shí)間點(diǎn)各組受試大白兔皮膚及對(duì)照皮膚反應(yīng)積分的平均分值，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15670—1995皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。

2.2.1 單次皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果：在單次皮膚刺激試驗(yàn)中，眼觀瑞香狼毒涂搽劑與對(duì)照組的大白兔試驗(yàn)區(qū)域破損皮膚與正常皮膚比較，出現(xiàn)了淡紅色的輕微紅腫，但屬于皮膚破損后的正常反應(yīng)，72 h后觀察破損皮膚，已恢復(fù)完全，無(wú)紅腫、變厚等現(xiàn)象，皮膚刺激得分均小于0.49（見(jiàn)表4），臨床用藥安全，屬于無(wú)刺激性藥品。

2.2.2 多次皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果：多次皮膚刺激試驗(yàn)中，眼觀瑞香狼毒涂搽劑組的完整皮膚區(qū)和破損皮膚區(qū)均無(wú)紅腫、變厚和色素沉著，無(wú)皮膚角質(zhì)層增厚，均痊愈完好。

2.3 眼刺激試驗(yàn)

大白兔眼中滴入瑞香狼毒涂搽劑后0、1、3、24、48、72 h觀察大白兔眼睛狀況可知，其眼角膜、結(jié)膜有輕微的損傷，眼虹膜沒(méi)有損傷（見(jiàn)圖7～圖12）。損傷程度得分參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15670—1995對(duì)照表，其結(jié)果見(jiàn)表5，急性眼刺激得分指數(shù)最高為 2.1； 試驗(yàn) 0、1、3、24、48、72 h 的眼刺激的平均分值分別為 2.1、1.8、1.2、0.6、0、0， 均在毒理學(xué)試驗(yàn)方法中眼刺激分級(jí)的輕度刺激性范圍內(nèi)，因此，瑞香狼毒涂搽劑對(duì)眼屬于輕度刺激性，可以安全使用。

圖5 完整皮膚試驗(yàn)區(qū)瑞香狼毒涂搽1次后的效果

圖6 完整皮膚試驗(yàn)區(qū)無(wú)菌超純水涂搽1次后的效果

圖7 剛滴入瑞香狼毒涂搽劑

圖8 滴入瑞香狼毒涂搽劑1 h后

表4 單次皮膚刺激試驗(yàn)

3 討論

瑞香狼毒涂搽劑試驗(yàn)組單次及多次給藥試驗(yàn)中皮膚有輕微紅腫，但效果不明顯，證明瑞香狼毒涂搽劑對(duì)皮膚刺激性不強(qiáng)；瑞香狼毒涂搽劑涂于大白兔的破損皮膚，無(wú)細(xì)菌感染，傷口恢復(fù)也較快，說(shuō)明其具有一定的抗炎、抗菌作用；急性毒性試驗(yàn)初步研究表明，其對(duì)小白鼠經(jīng)口急性毒性為低毒。

圖9 滴入瑞香狼毒涂搽劑3 h后

圖10 滴入瑞香狼毒涂搽劑24 h后

圖11 滴入瑞香狼毒涂搽劑48 h后

圖12 滴入瑞香狼毒涂搽劑72 h后

表5 眼部刺激試驗(yàn)結(jié)果

瑞香狼毒涂搽劑作為植物源獸藥應(yīng)用于畜牧業(yè)中，從保護(hù)環(huán)境的角度出發(fā)，瑞香狼毒嚴(yán)重地危害著優(yōu)質(zhì)牧草的生長(zhǎng)，其蔓延速度之快也破壞了草原的生態(tài)環(huán)境。但同時(shí)，瑞香狼毒也是一種著名的天然藥用植物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗驚厥、治療和預(yù)防免疫缺陷及殺蟲(chóng)作用等［6］，因此，開(kāi)展瑞香狼毒有效成分的提取、利用，既能有效抑制瑞香狼毒繁殖蔓延，控制草場(chǎng)退化，保護(hù)草原生態(tài)環(huán)境，又能合理利用大量自然資源，變害為寶。植物源獸藥的使用對(duì)環(huán)境污染小，動(dòng)物較難產(chǎn)生抗藥性，選擇性強(qiáng)，對(duì)人、畜及天敵毒性低，開(kāi)發(fā)和使用成本相對(duì)較低，故開(kāi)發(fā)這種有毒的藥用植物具有良好的前景和應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

［1］秦寶福，周樂(lè)，苗芳，等.瑞香狼毒根的抑菌活性研究（Ⅰ）［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（11）：1977-1980.

［2］龔曉霞，李文娟，歐陽(yáng)秋，等.瑞香狼毒根中抑菌活性成分的研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，43（3）：697-701.

［3］姜翠寶，田淑琴，沈克菇.瑞香狼毒綏釋注射液對(duì)家兔毛癬病的藥效［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2008（8）：33-34.

［4］鄧孝廷，田淑琴，陳烽烽，等.瑞香狼毒涂搽劑治療獺兔皮膚真菌病的臨床試驗(yàn)研究 ［J］.中國(guó)養(yǎng)兔，2011（9）：4-5，8.

［5］寶國(guó)噗，徐平，寶艷蕾.瑞香狼毒的開(kāi)發(fā)及綜合利用［EB/OL］.（2012-11-06）.Web www.healthoo.com.

［6］竇洪舉，李鋒，侯勇躍.狼毒及瑞香狼毒的研究進(jìn)展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2013，34（11）：43-47.