BSP和整合素αvβ3在口腔鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

侯 捷 王海霞 張玲敏 毛立民

口腔鱗狀細胞癌是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤，是世界范圍內第8大常見癌癥[1]，每年全世界新增病例超過30萬例[2]。近20年來，盡管其發(fā)病機制與治療方法得到廣泛研究與發(fā)展，但口腔癌患者5年生存率仍維持在50%[1]。

口腔鱗癌具有快速增長，高度局部浸潤和頸淋巴結轉移的特性[3]。當前，口腔鱗癌的預后判斷主要依靠腫瘤的原發(fā)部位、大小、是否發(fā)生頸淋巴結轉移以及有無遠處轉移。然而，口腔鱗癌的生物學行為具有顯著異質性，并且臨床分期相同的腫瘤，其臨床進程及治療反應不盡相同。因此，確定腫瘤侵襲、轉移的關鍵因素，建立新的診斷和預后判斷方法以及采用新的治療策略顯得尤其重要。

相關研究顯示，BSP與腫瘤的浸潤、轉移存在相關性[4]，且BSP均不同程度上受到整合素αvβ3的誘導作用。近年研究表明BSP和整合素αvβ3存在于各種腫瘤，如肺癌[5]，乳腺癌[6]，甲狀腺癌[7]等。兩者在口腔鱗狀細胞中的研究未見報道?；谶@一背景，本研究通過免疫組織化學法檢測BSP及整合素αvβ3在OSCC及正?？谇火つぶ械谋磉_，分析二者表達與OSCC臨床病理特征的關系以及兩者相關性，以期為OSCC的診斷及預后評估提供應用價值。

一、材料和方法

1.一般材料

（1）標本選擇：收集哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科2013～2016年手術切除的，術前未采用任何針對腫瘤的治療，如放療、化療等，經(jīng)組織蠟塊保存完好的口腔鱗癌標本。均經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為鱗狀細胞癌。

（2）臨床資料：口腔鱗癌患者例，男46例，女14例，年齡42～78歲，平均60歲。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2010年關于惡性腫瘤TNM分期的規(guī)定將病例分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，其中Ⅰ期～Ⅱ期35例，Ⅲ期～Ⅳ期25例。依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）組織學分化程度標準將病例分類，高分化34例，中低分化26例。術后病理結果頸淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者35例所收集的石蠟標本均由病理學專業(yè)醫(yī)師證實并且臨床資料齊全。同時選取20例口腔正常黏膜組織標本作為免疫組化染色的實驗對照，所有患者既往身體健康，無腫瘤病史。

（3）主要試劑：一抗兔抗人BSP多克隆抗體（abcam公司，英國），鼠抗人Integrinαvβ3鼠單克隆抗體（SANTA CRUZ公司美國），二抗羊抗兔，羊抗鼠，濃度為1∶50；封閉用正常羊血清，濃度為1∶10（北京索萊寶科技有限公司）通用型SP免疫組化檢測試劑盒及DAB試劑盒（博士德生物有限公司）。

2.實驗方法

（1）免疫組化方法：60例OSCC組織和20例正常口腔黏膜組織石蠟標本制成4μm切片后常規(guī)脫蠟至水，抗原修復后按照說明書步驟進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察切片。

（2）結果判定：BSP蛋白表達以細胞質或細胞核周圍區(qū)域中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；Integrin αvβ3蛋白表達在癌細胞漿或細胞膜中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。結合腫瘤細胞染色的百分比及染色強度進行評分：陽性細胞數(shù)≤10%為0分，陽性細胞數(shù)11%～50%為1分，陽性細胞數(shù)51%～75%為2分，陽性細胞數(shù)＞75%為3分。按染色強度評分：無黃色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色陽性細胞數(shù)與染色強度之和≥3分者為陽性表達，＜3分者為陰性表達。

3.統(tǒng)計學方法

用Excel收集數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以頻數(shù)和百分數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關系數(shù)分析相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.BSP和Integrinαvβ3在OSCC及正常組織中的表達

BSP在OSCC細胞質或細胞核周圍區(qū)域中呈高表達，而在正常上皮無表達或極少數(shù)弱表達；Integrinαvβ3定位于OSCC細胞細胞漿或細胞膜內，正常上皮細胞基底層表達極弱（圖1）。在口腔鱗癌組織中，BSP、整合素αvβ3的表達強度顯著高于口腔正常黏膜組織（P＜0.01）（表1）。

圖1 免疫組化檢測BSP和Integrinαvβ3在口腔鱗癌及口腔正常黏膜組織中的表達（SP ×200）

表1 BSP與Integrinαvβ3在OSCC及正常組織中的表達

表2 BSP與Integrin αvβ3表達與OSCC臨床病理特征的關系

2.BSP、Integrinαvβ3的表達與OSCC臨床病理因素分析

60例OSCC患者中，BSP、Integrinαvβ3的表達水平與性別，年齡無明顯差異（P＞0.05）。而均與分化程度、TNM分期，淋巴結轉移相關。分化程度越低、TNM分期在Ⅲ～Ⅳ，發(fā)生淋巴結轉移，BSP和Integrinαvβ3相對表達明顯增高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

3.BSP與Integrinαvβ3在口腔鱗狀細胞癌中表達的相關性

采用Spearman秩相關系數(shù)檢驗，結果顯示OSCC組BSP與Integrinαvβ3間相關系數(shù)為r＝0.257（P＜0.05），二者存在正相關性，表明BSP的表達隨Integrinαvβ3的表達增強而增強（表3）。

表3 BSP和αvβ3在OSCC組織中表達的相關性

三、討論

口腔鱗狀細胞癌（OSCC） 是口腔科最常見的惡性腫瘤之一。細胞外基質（exnacellular matrix，ECM）不僅決定細胞的形態(tài)，還可控制細胞的生長、分化，調節(jié)細胞的運動。一般狀態(tài)下，ECM通過不斷生長和降解保持動態(tài)平衡，其蛋白聚糖、膠原蛋白、彈性蛋白的成分降解主要依靠蛋白水解酶的作用。腫瘤細胞的侵襲轉移過程常常伴有細胞外基質的降解。侵襲和轉移是惡性腫瘤最基本的生物學特征。

骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）是一種高度糖基化、磷酸化、硫酸化的多功能非膠原蛋白，屬 于 SIBLING（small integrin binding ligand，N-linked Glycoprotein）蛋白家族[8]，其主要分布于礦化相關組織，在多種惡性腫瘤中也有異常表達。Bellahecene等[9]人首先闡述了BSP基因在骨轉移的人乳腺癌中表達，由此也成為研究乳腺癌易發(fā)生骨轉移的開端，并奠定了基礎，推動了更深一步來研究BSP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。此外，Tang H[10]等人發(fā)現(xiàn)BSP的異常表達可能在ESCC的惡性進展及預后有顯著的作用，并與其分化程度和淋巴結轉移有關，可能是反映ESCC的生物學行為的一個標志。BSP是骨細胞外基質中的重要蛋白。有研究報道[11]，MMP是鋅依賴的內切酶超家族，它幾乎能降解所有的ECM成分，BSP可促進腫瘤細胞分泌MMP，并提高MMP活性，增強腫瘤細胞突破ECM能力，促進腫瘤細胞成功轉移到其他組織。

整合素是一種廣泛分布于各種脊椎動物細胞膜表面受體，在多種腫瘤表面的異常表達，對癌細胞發(fā)展具有十分重要的作用，整合素αvβ3是由αv亞基和β3亞基組成的異源二聚體，是整合素家族的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3與配體結合后激活了胞內的多條信號傳導通路，影響細胞的形態(tài)變化、增殖、凋亡等生物學行為，進而促進腫瘤細胞侵襲轉移的發(fā)生[12]。其不僅可以介導細胞和ECM間、以及細胞和細胞間的粘附作用，還能作為一種信號轉導分子傳遞信號。

腫瘤細胞彼此間黏附能力減弱而腫瘤細胞與宿主細胞及ECM間的黏附能力增加，有利于腫瘤 細胞脫離母體腫瘤，是實現(xiàn)轉移的第一步。此過程由細胞黏附分子所介導，細胞黏附分子主要有選擇素、整合素、免疫球蛋白超家族、鈣勃素等。Oldberg等人[13]首次證實了整合素是BSP的受體，BSP通過RGD細胞識別序列與骨肉瘤細胞表面整合結合，并介導癌細胞表面與ECM間的黏附作用。其次新生血管的形成對原發(fā)性腫瘤細胞的生長和增殖是不可缺少的，可使腫瘤從無血管的緩慢生長階段進人快速增殖階段。隨著腫瘤微血管密度的增加，腫瘤侵襲轉移等惡性潛能也增強。血管生成進程依賴于內皮細胞和ECM中特異分子的相互作用，整合素介導了這一過程。整合素在靜止的血管細胞中低表達或不表達，而在處于生理或病理狀態(tài)中的血管生成內皮細胞中高表達，而BSP的RGD基序恰是整合素αvβ3的識別位點。許多研究發(fā)現(xiàn)BSP是一種血管生成因子，具有調解血管內皮細胞赫附、遷移，誘導血管生成的作用[14]。

我們研究還發(fā)現(xiàn)，在口腔正常上皮BSP和整合素αvβ3基本不表達。在口腔鱗癌組織中，BSP和整合素αvβ3的表達強度顯著高于口腔正常黏膜組織。這表明隨著上皮細胞異型性的加重，BSP和整合素αvβ3的表達量增加。BSP和整合素αvβ3的表達與腫瘤的分化程度，TNM分期，淋巴結轉移呈正相關，提示兩者對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有協(xié)同促進作用。因此我們認為，兩者在口腔癌局部組織可能存在調控關系。

綜上所述，BSP和整合素αvβ3在口腔鱗癌中表達增加，并與口腔鱗癌的浸潤、轉移密切相關，可作為口腔鱗癌患者預后判斷指標及治療的靶向目標。未來期間對于BSP和整合素αvβ3的相關性及調控關系需進一步研究證實。

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