生物活性玻璃治療牙本質(zhì)過(guò)敏癥的長(zhǎng)效性體外研究

史舒雅 武 瓊 許玉婷 陳亞明

牙本質(zhì)過(guò)敏癥的定義是牙齒在受到外界刺激，如溫度、化學(xué)物質(zhì)以及機(jī)械作用等引起的酸、軟、痛癥狀。它不是一種獨(dú)立的疾病，而是各種牙體疾病所共有的癥狀[1，2]。它與釉質(zhì)缺失和（或）根面暴露所致的牙本質(zhì)小管暴露密切相關(guān)[1，2]。多種因素可致牙本質(zhì)小管暴露，如牙合面磨損、磨耗、食物酸蝕、副功能運(yùn)動(dòng)、牙齦萎縮、老齡化、慢性牙周疾病、牙列不齊、牙周手術(shù)、不正確的刷牙方法、冠橋修復(fù)牙體預(yù)備以及牙折[1，3]。

流體動(dòng)力學(xué)理論認(rèn)為牙本質(zhì)過(guò)敏癥是由于暴露的牙本質(zhì)小管內(nèi)異常的液體流動(dòng)造成的[4]。因此，封閉牙本質(zhì)小管能阻斷管內(nèi)液體流動(dòng)，從而緩解癥狀[5]。多種材料、方法能達(dá)到良好的短期脫敏效果[6]。然而日常牙合面磨損、唾液或者酸性飲食能重新打開(kāi)封閉的牙本質(zhì)小管，使得治療效果維持時(shí)間較短[7，8]。一些體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)食物酸性會(huì)增加牙齒敏感的可能[9]。因此，理想的脫敏劑不僅需降低牙本質(zhì)的滲透性，同時(shí)要經(jīng)受酸性飲食及唾液浸泡的考驗(yàn)[10]。

生物活性玻璃具備封閉牙本質(zhì)小管和再礦化牙本質(zhì)的能力。它最初用于刺激新骨形成，隨后被用作骨科植入物涂層以促進(jìn)植入物與骨的結(jié)合[11，12]，后又用于充填牙周骨缺損[13，14]。最近，含有生物活性玻璃的脫敏劑被證實(shí)能有效緩解牙本質(zhì)過(guò)敏癥狀[15]。此外，關(guān)于生物活性玻璃的細(xì)胞毒性研究表明這是一種高度生物相容性的材料[16～18]。盡管各種脫敏劑能在短期內(nèi)減緩牙齒敏感的癥狀，但是關(guān)于其長(zhǎng)期性的研究較少。

本體外實(shí)驗(yàn)研究的目的是比較含有生物玻璃的脫敏劑與另外兩種脫敏劑治療牙本質(zhì)過(guò)敏癥的長(zhǎng)期效果，為臨床治療牙本質(zhì)過(guò)敏癥提供理論參考。

資料和方法

一、樣本的制備

收集新鮮拔除的無(wú)齲、無(wú)裂紋、無(wú)修復(fù)體的人類第三磨牙50顆，徹底清潔后貯存于4℃的含有0.5%麝香草酚的去離子水中。平行于夾持板平面包埋固定，用低速切割機(jī)（Isomet Low Speed Saw，Buehler Ltd，美國(guó)）將牙體于釉牙骨質(zhì)界上1.0mm處，垂直牙體長(zhǎng)軸切成1.0mm厚的牙本質(zhì)盤，用點(diǎn)標(biāo)記近冠面和近髓面，在持續(xù)水流沖洗下，牙本質(zhì)盤用600目的碳化硅砂紙打磨30秒。將樣本浸入0.5M 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）溶液（pH＝7.4）中2分鐘去除玷污層，隨后用大量蒸餾水沖洗3分鐘。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.將樣本按隨機(jī)數(shù)字表分為5組（N＝10）。組1、2、3、4分別用生物活性玻璃、冷酸靈、高露潔抗敏和蒸餾水每天上午9點(diǎn)和下午5點(diǎn)處理2分鐘；組5為對(duì)照組，不做任何處理。采用的是兩組軟毛電動(dòng)牙刷（Colgate 360°，Colgate-Palmolive Co.），15日后更換。表1為三種脫敏劑的生產(chǎn)廠家和有效成分。每天脫敏處理樣本后于上午10點(diǎn)浸泡在咖啡（pH＝5.4）中5分鐘，下午6點(diǎn)浸泡在可樂(lè)（pH＝2.5）中5分鐘。每次脫敏處理和酸性飲料浸泡后，將樣本放于蒸餾水中超聲震蕩清洗。處理間隔期將樣本貯存于常溫（36±1.0℃）人工唾液中。使用的人工唾 液 配 方 為 1.5mM/L CaCl2，50mM/L KCl，0.9 mM/L KH2PO4and 20mM/L Tris（pH＝7.4）。

表1 三種脫敏劑的生產(chǎn)廠家及主要成分

2.電化學(xué)阻抗檢測(cè)：在樣本處理2天后以及之后每隔7天進(jìn)行一次樣本的電化學(xué)阻抗值測(cè)定。采用的是電化學(xué)工作站（IM6，ZAHNER-Elektrik GmbH&Co.KG，Kronach，德國(guó)）。將牙本質(zhì)盤置于含有一對(duì)橡膠“O環(huán)”（直徑6㎜）的U型分裂腔裝置中，該裝置與Pashley等人提出的液壓傳導(dǎo)裝置相似[19]。玻碳電極（CHI104，CHI Instruments，Inc.，Austin，TX，USA）作為工作電極，鉑電極（CHI120，CHI Instruments，Inc.，美國(guó)）作為對(duì)電極分別放入兩個(gè)半腔中。樣本的合面朝向工作電極。Ag/AgCl電極（CHI111，CHI Instruments，Inc.，美國(guó)）用作參比電極。兩個(gè)半腔中充滿了0.1M KCl作為電解液。樣本在進(jìn)行電化學(xué)阻抗值測(cè)定前需浸泡在電解液2日排除殘留的空氣，每次測(cè)定均需更換電解液。采用振幅為10mV的正弦電壓信號(hào)，頻率設(shè)為0.1Hz到60kHz之間，獲得奈奎斯特阻抗譜。影響阻抗值（kΩ）的因素包括電解液、樣本以及電極的電阻值。因此，樣本的阻抗值 R（d）等于總的阻抗值 R（t）減去電解液的阻抗值R（e）。同時(shí)，當(dāng)Z值（交流阻抗矢量）最低時(shí)，它接近 R（t）。R（e）值是通過(guò)單獨(dú)測(cè)定0.1M KCl電解液的阻抗值獲得，其通常能穩(wěn)定維持2～3小時(shí)。

3.原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）觀察：將5組樣本處理一個(gè)月后進(jìn)行原子力顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)組（組1、2、3）各選取2個(gè)樣本。將樣本逐個(gè)包埋于丙烯酸樹(shù)脂中，然后依次用1.00μm，0.30μm和0.05μm的氧化鋁拋光粉拋光，超聲震蕩清洗后干燥備用。原子力顯微鏡（CSPM 5000，Ben Yuan Ltd，中國(guó)）采用敲擊模式（tapping mode），探針可周期性地接觸樣本表面獲得較少偽影的高清圖像[20，21]。本實(shí)驗(yàn)使用AC160TS-C2型號(hào)的AFM探針（Olympus公司，日本），其共振頻率 ~300kHz，彈簧力常數(shù)~42N/m。圖像掃描速率為~1.5Hz，分辨率為512×512像素，其中最大垂直和橫向分辨率分別為0.1nm和0.2nm。采用AFM儀器制造商提供的數(shù)據(jù)分析軟件定量分析牙本質(zhì)小管的直徑變化。

4.掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）觀察：樣本處理一個(gè)月后，大量蒸餾水沖洗、干燥器干燥，然后噴金以增加導(dǎo)電性。掃描電鏡（JSM6000，JEOL，日本）選取 20kV加速電壓。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

電化學(xué)阻抗值采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各個(gè)時(shí)間段所測(cè)得的每組樣本的EIS值以及原子力顯微鏡觀察到的牙本質(zhì)小管直徑用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。Levene’s法測(cè)試方差齊性后，采用雙因素方差分析和Post hoc LSD確定各組值是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

結(jié) 果

一、電化學(xué)阻抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

樣本EDTA脫礦、脫敏劑和酸性溶液處理2天，9天，16天，23天，30天的牙本質(zhì)盤阻抗值見(jiàn)表2和圖1。

表2 EDTA脫礦、脫敏劑和酸性溶液處理2天、9天、16天、23天、30天后的牙本質(zhì)盤阻抗值（kΩ）*

雙因素方差分析結(jié)果顯示時(shí)間（F＝7.42；P＜0.05）和分組（F＝12.07；P＜0.05）都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Post hoc LSD結(jié)果提示，使用生物活性玻璃處理與其他組相比能顯著降低牙本質(zhì)的滲透性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但高露潔組除外（P＝0.324）。所有時(shí)段生物活性玻璃組產(chǎn)生的EIS值均最高。組4蒸餾水處理所獲得的EIS值較組5（對(duì)照組）低，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.25）。組2使用冷酸靈處理所獲得的EIS值較組5略高，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.29）。

二、原子力顯微鏡結(jié)果

圖2顯示的是組1、2、3樣本經(jīng)過(guò)脫敏處理1個(gè)月后的AFM圖像。組1圖像可以看到樣本表面有顆粒狀的管間沉積物，牙本質(zhì)小管徑縮小最明顯。組1（生物活性玻璃）、組2（冷酸靈）、組3（高露潔抗敏）測(cè)得的牙本質(zhì)小管徑分別為817±156μm，1231±277μm和 944±230μm。其中，組2與組1（P＜0.01）和組3（P＜0.05）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 樣本EDTA脫礦、脫敏劑和酸性溶液處理2天，9天，16天，23天,30天的牙本質(zhì)盤阻抗值

圖2 組1、2、3樣本經(jīng)過(guò)脫敏處理1個(gè)月后的AFM圖像

三、掃描電子顯微鏡結(jié)果

圖3顯示的是組1、2、3樣本經(jīng)過(guò)脫敏處理1個(gè)月后選取的SEM圖像。使用生物活性玻璃處理后（圖3-A，3-B）呈現(xiàn)出類似于玷污層的較均勻的顆粒狀牙本質(zhì)表面，極少數(shù)牙本質(zhì)小管仍開(kāi)放但管徑已顯著縮小，呈現(xiàn)出最佳的小管封閉效果。 使用冷酸靈（圖3-C，3-D）和高露潔抗敏（圖3-E，3-F）處理后的表面牙本質(zhì)小管凸度降低、管徑縮小，可見(jiàn)小顆粒沉積在牙本質(zhì)表面、部分封閉牙本質(zhì)小管，高露潔組封閉效果更明顯。蒸餾水組（圖3-G，3-H）和對(duì)照組（圖3-I，3-J）呈現(xiàn)出擴(kuò)大的牙本質(zhì)小管徑，其中蒸餾水組樣本表面可見(jiàn)少量牙本質(zhì)碎屑，部分進(jìn)入管內(nèi)。

圖3 組1、2、3樣本經(jīng)過(guò)脫敏處理1個(gè)月后選取的SEM圖像

討 論

治療牙本質(zhì)過(guò)敏癥的方法可分為物理和化學(xué)兩類[22]?；瘜W(xué)方法包括氯化鍶、氟化鈉、福爾馬林溶液[23]、草酸鐵[24]、氫氧化鈣、氫氧化錫、草酸鈣、磷酸鐵[25]以及硝酸鉀[26]；物理方法包括釋放氟的樹(shù)脂[27]和激光[28～30]。這些材料脫敏效果理想，但維持時(shí)間相對(duì)較短。日常刷牙、咀嚼以及口內(nèi)唾液和酸性飲食的接觸，會(huì)使這些材料逐漸磨損或溶解，最終失去封閉效果[6]。因此，評(píng)價(jià)治療牙本質(zhì)過(guò)敏癥的材料時(shí)，必須將其長(zhǎng)期脫敏效果考慮在內(nèi)。根據(jù)解釋牙本質(zhì)過(guò)敏癥疼痛的液體動(dòng)力學(xué)理論[4，31]，生物活性玻璃的小管封閉能力成為近年來(lái)研究關(guān)注的熱點(diǎn)。

電化學(xué)阻抗法是一種靈敏且非破壞性的方法，可用于評(píng)價(jià)牙本質(zhì)小管的封閉情況。它已經(jīng)被用于評(píng)價(jià)酸引起的牙本質(zhì)滲透性改變[19，32]、樹(shù)脂-牙本質(zhì)粘結(jié)的有效性[33]、樹(shù)脂復(fù)合物修復(fù)體的微滲漏[34]以及根管治療后臨時(shí)性修復(fù)體的封閉[35]。采用電化學(xué)阻抗法測(cè)量牙本質(zhì)盤滲透性需先浸泡樣本使電解液滲入從而導(dǎo)電。所獲得的電化學(xué)阻抗波常與樣本微結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，牙本質(zhì)樣本的電化學(xué)阻抗值取決于樣本兩側(cè)半腔內(nèi)的電勢(shì)差，以及貫穿牙本質(zhì)小管的電流[19]。牙本質(zhì)小管的封閉會(huì)降低液壓傳導(dǎo)性、增加電阻抗值，即小管開(kāi)放多阻抗值低、小管開(kāi)放少阻抗值高[19]。

電化學(xué)阻抗結(jié)果表明含有生物活性玻璃的脫敏劑處理后樣本的滲透性最低。處理第2天，所有樣本的EIS值均有上升趨勢(shì)，其中生物活性玻璃組上升最顯著，提示生物活性玻璃與冷酸靈和高露潔相比能迅速起效，見(jiàn)表2。作為一種生物相容性材料，生物活性玻璃能在體內(nèi)形成磷灰石晶體封閉開(kāi)放的牙本質(zhì)小管，抑制溫度或觸覺(jué)刺激的傳導(dǎo)從而緩解或消除牙本質(zhì)過(guò)敏癥。磷灰石的形成是通過(guò)一系列相互依賴的序列反應(yīng)而得到：生物活性玻璃逐漸溶解后表面形成Si-OH基團(tuán)[11]、隨后聚合生成Si-O-Si基團(tuán)、無(wú)定形沉積物吸附于玻璃表面后晶化為碳酸羥基磷灰石層（hydroxy carbonate apatite，HCA）、組織液中的生物成分（膠原纖維等）吸附在HCA層上、巨噬細(xì)胞及成骨細(xì)胞的附著及活動(dòng)、基質(zhì)的生成及結(jié)晶化，最終形成磷灰石[36]。

冷酸靈的有效成分為氯化鍶和硝酸鉀，兩者都被廣泛應(yīng)用于牙膏治療牙本質(zhì)過(guò)敏癥。由于鉀離子能夠降低敏感牙齒的神經(jīng)興奮性，另體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)鍶鹽能增加脫礦牙本質(zhì)的礦物密度[37]、也能與氟化物協(xié)同起效[38]。然而，本實(shí)驗(yàn)中冷酸靈處理后牙本質(zhì)滲透性的改變與空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.29）。研究證實(shí)含有8%精氨酸和1450ppm氟化物的高露潔脫敏牙膏能顯著緩解牙本質(zhì)過(guò)敏癥[39]。這種Pro-Argin配方的牙膏能有效地封閉牙本質(zhì)小管，含有精氨酸的牙本質(zhì)沉積物能有效低抵抗酸蝕[40]。在本體外實(shí)驗(yàn)中，生物活性玻璃組和高露潔組所造成的牙本質(zhì)滲透性改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.32）。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蒸餾水組和空白對(duì)照組在經(jīng)過(guò)EDTA脫礦和人工唾液浸泡后，都能在短期（2天）內(nèi)使牙本質(zhì)的滲透性降低，隨后升高，見(jiàn)表2。曾有研究證實(shí)使用蒸餾水刷牙能在牙本質(zhì)小管內(nèi)保留部分玷污層殘余物[15]，本實(shí)驗(yàn)中，純可樂(lè)浸泡樣本后使用去離子水刷牙也能在牙本質(zhì)小管內(nèi)保留部分玷污層殘余物。而空白對(duì)照組沒(méi)有觀察到顯著的形態(tài)學(xué)改變[9]。人工唾液能溶解牙本質(zhì)小管內(nèi)的顆粒物，增加牙本質(zhì)的滲透性[10]；而再礦化時(shí)，人工唾液中礦物鹽成分可能在牙本質(zhì)表面沉積晶體，降低牙本質(zhì)的滲透性[7]。牙本質(zhì)滲透性的改變除與脫敏處理有關(guān)，也能反應(yīng)脫礦和再礦化的循環(huán)過(guò)程。

原子力顯微鏡不止能提供樣本表面的形態(tài)改變，同時(shí)能提供精確的定量信息，諸如尺寸、粗糙度和周期[41]。與掃描電鏡相比，原子力顯微鏡具備偽影更少，無(wú)需物理或化學(xué)固定、樣本表面無(wú)需涂層來(lái)獲得更好的對(duì)比度和導(dǎo)電性等優(yōu)點(diǎn)。但是，和掃描電子顯微鏡相比，原子力顯微鏡的缺點(diǎn)在于成像范圍太小，速度慢，受探頭的影響太大[20，21]。因此，本實(shí)驗(yàn)中既采用了原子力顯微鏡觀察小管的封閉情況，又采用了掃描電子顯微鏡獲得成像范圍更大的圖像來(lái)觀察樣本的表面形態(tài)。觀察生物樣本時(shí)，采用輕敲模式有助于避免探針摩擦造成的表面損傷[42]。由于本實(shí)驗(yàn)中使用的精細(xì)拋光粉末直徑（1.00μm，0.30μm和0.05μm）小于人年青第三恒磨牙的平均牙本質(zhì)小管直徑（1.21±0.08μm）[43]，必須將樣本放入蒸餾水中超聲振蕩30分鐘后再進(jìn)行原子力顯微鏡觀察。處理1個(gè)月后，組1、2、3牙本質(zhì)小管平均直徑分別為 817±156μm，1231±277μm，944±230μm。組2的小管徑顯著大于組 1（P＜0.05）或組 3（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與人年青第三恒磨牙的平均牙本質(zhì)小管徑相比，組1和組3的管徑明顯縮小。

三種脫敏劑都能不同程度地長(zhǎng)期降低牙本質(zhì)小管滲透性。日常刷牙所沉積在牙本質(zhì)小管內(nèi)的材料能在1個(gè)月內(nèi)有效低抵抗酸性溶液和人工唾液的浸泡。生物活性玻璃能夠迅速降低牙本質(zhì)的滲透性，降低程度比高露潔高，但不具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.32），兩者與冷酸靈相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。因此，無(wú)效假設(shè)僅對(duì)高露潔成立。

體外實(shí)驗(yàn)的局限性在于活髓牙與牙本質(zhì)模型存在一定差異，活髓牙中牙本質(zhì)小管內(nèi)充滿牙本質(zhì)小管液并存在液體靜壓力（14.1cm H2O），因此推測(cè)對(duì)活髓牙牙髓壓力的存在也可能影響脫敏劑封閉牙本質(zhì)小管的長(zhǎng)期有效性。因此，還需進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)本體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。

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