多花黃精組培苗快速繁殖體系建立研究△

莫勇生，盧拓方*，邱展鴻，張紅巖，孫文波

(1.廣西科學(xué)院生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西華泰生物科技有限公司，廣西 昭平 546800)

多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua為百合科黃精屬多年生草本植物，野生資源主要分布于廣西賀州境內(nèi)昭平、八步縣區(qū)，根莖形狀呈姜型。其生長(zhǎng)環(huán)境多處于山坡背陽(yáng)面小灌木叢中，植株高約30～40 cm，葉片呈長(zhǎng)弧形。

成熟后的多花黃精其干燥根莖入藥。據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)藥經(jīng)典記載，黃精屬于名貴中藥，具有寬中益氣、益腎填精、滋陰潤(rùn)肺，生津補(bǔ)脾之功效[1-2]。 對(duì)治療心血管疾病、結(jié)核病、慢性肝炎以及在抗菌、解毒、抗疲勞、抗衰老、降血糖、降血脂抗腫瘤等方面均有較好作用。黃精既可入藥，又可作為保健食品的原料。隨著市場(chǎng)對(duì)黃精藥材需求量的增加和野生資源的急劇減少，采集野生黃精不但不能滿足市場(chǎng)需求，反而可能破壞生態(tài)環(huán)境和多花黃精野生資源。由此人們逐漸開始對(duì)多花黃精的野生變家種栽培技術(shù)、高產(chǎn)栽培技術(shù)等加以實(shí)踐。目前多花黃精的人工種植主要依靠根莖繁殖和種子繁殖，但根莖繁殖方法繁殖系數(shù)低，種根莖用量大，既不經(jīng)濟(jì)，又限制了多花黃精的產(chǎn)量潛力，不便栽植管理推廣。多花黃精種子繁殖的繁殖系數(shù)比較高，但用時(shí)比較久，一般種子繁殖移栽苗需要3年時(shí)間。因此說(shuō)，目前多花黃精種苗問(wèn)題成為制約黃精人工大規(guī)模種植的瓶頸[3]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立起多花黃精組培苗規(guī)模化生產(chǎn)體系是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多花黃精種苗有效的途徑。

多花黃精為多年生植物，地下根莖常附著太多土壤微生物，若用根莖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，在消毒滅菌環(huán)節(jié)很難把控。本試驗(yàn)曾多次用根莖作為外植體，污染率高，很難獲得無(wú)菌培養(yǎng)組織，所以最終采取用成熟種子來(lái)萌發(fā)芽獲得無(wú)菌外植體材料。本研究對(duì)黃精的繁殖從種子到組培種苗過(guò)程進(jìn)行研究，為多花黃精種苗規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，以達(dá)到短期內(nèi)生產(chǎn)出大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗的目標(biāo)，可以應(yīng)用到黃精的人工種植產(chǎn)業(yè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 黃精種子 多花黃精生長(zhǎng)于賀州市昭平縣廣西華泰生物科技有限公司生產(chǎn)基地，種子植株花白色，花期5～6月，果期8～10月，地下根莖呈姜狀。成熟的多花黃精種子采收于2016年10月，清洗并浸水30 min后用紗袋包裹放置于26 ℃恒溫干燥培養(yǎng)箱催芽待用。

1.1.2 培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基[3-4]，建立多花黃精組織培養(yǎng)的三種培養(yǎng)基配方：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

配方培養(yǎng)基種類激素濃度/mg·L-16?BANAAGA3A1MS1 00 20 0A2MS1 00 20 5A3MS1 50 20 0A4MS1 50 20 5A5MS2 00 20 0A6MS2 00 20 5

增殖培養(yǎng)基：

配方培養(yǎng)基種類激素濃度/mg·L-16?BANAAB1MS0 50 2B2MS1 00 2B3MS1 50 2B4MS2 00 2B5MS2 50 2B6MS3 00 2

生根培養(yǎng)基：

配方培養(yǎng)基種類激素濃度/mg·L-1IBANAAC11/2MS0 20 02C21/2MS0 50 05C31/2MS0 80 08C41/2MS1 00 10C51/2MS1 20 12C61/2MS1 50 15

以上培養(yǎng)基均為添加蔗糖20 g·L-1，瓊脂粉4 g·L-1，PH值為5.8～6.0。

1.2 方法

黃精組織培養(yǎng)過(guò)程均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作。培養(yǎng)房環(huán)境溫度為(26±2)℃，光照強(qiáng)度為2000 Lx，時(shí)間12 h·d-1。

1.2.1 種子消毒與萌芽 將培養(yǎng)箱中催芽待用的種子，浸水去掉漂浮的種子用自來(lái)水漂洗三次。在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒處理：將種子放入玻璃瓶?jī)?nèi)，用無(wú)菌水沖洗3次用75% 酒精漂洗30 s，倒掉酒精，用0.13% 的氯化汞溶液表面滅菌4～6 min后，再用無(wú)菌水沖洗4～5次，取出種子用無(wú)菌紗布瀝干。將種子接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接3顆種子，每個(gè)配方接20瓶，放在培養(yǎng)室培養(yǎng)。啟動(dòng)誘導(dǎo)前階段(5～10 d)，種子萌發(fā)形成小球莖，繼續(xù)培養(yǎng)5～10 d，小球莖組織形成生長(zhǎng)點(diǎn)而萌發(fā)出芽，接種25 d后，觀察各個(gè)配方的萌芽情況。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 萌芽的小球莖繼續(xù)培養(yǎng)，球莖基部繼續(xù)膨大，長(zhǎng)到1 cm左右大小時(shí)，將球莖切成0.2～0.3 cm的小塊接種至繼代增殖培養(yǎng)基中。每瓶只接入5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)配方接種20瓶。放置培養(yǎng)房?jī)?nèi)培養(yǎng)25 d，小球莖繼續(xù)萌發(fā)出芽，觀察和統(tǒng)計(jì)各自增殖情況，重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.2.3 生根壯苗 在繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，選取株型較好，植株粗壯的繼代苗，接種于生根培養(yǎng)基中。每瓶接入4株苗，每個(gè)配方接種20瓶。放置培養(yǎng)室先暗培養(yǎng)20 d轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)20 d，觀察和統(tǒng)計(jì)各自生根情況。

1.2.4 室外煉苗移栽 生根培養(yǎng)40 d后，搬出培養(yǎng)房，放置自然環(huán)境7 d，選取有3條以上正常根系的生根苗，清洗掉根系附著的培養(yǎng)基，栽植于(沙子∶泥炭土=1∶1)的煉苗基質(zhì)中，每10 d噴施1次營(yíng)養(yǎng)液，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌外植體的獲得

種子處理接種培養(yǎng)第10 d，觀察發(fā)現(xiàn)有的種子開始萌發(fā)芽(圖1)，25 d后觀察發(fā)現(xiàn)萌芽基部膨大分化成球莖(圖2)。

圖1 接種的種子

圖2 發(fā)芽的種子

試驗(yàn)過(guò)程中記錄和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得出表1。由表1可以看出，啟動(dòng)培養(yǎng)基配方當(dāng)中，BA濃度升高，其萌芽率也隨之提高。在試驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)BA濃度提高到2.0 mg·L-1(A5、 A6)濃度時(shí)，其萌芽率雖然較高，可是基部出現(xiàn)較多愈傷組織(圖3)，這可能是由于激素濃度過(guò)高造成的。因此啟動(dòng)培養(yǎng)誘導(dǎo)芽階段BA濃度不宜超過(guò)1.5 mg·L-1。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，添加GA3的A2、 A4、A6配方均在培養(yǎng)10 d左右就開始萌芽，沒(méi)有添加GA3的A1、 A3、A5均在15 d后才開始萌發(fā)，結(jié)合試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)還看出在相同BA濃度基礎(chǔ)上，GA3對(duì)萌發(fā)率影響不大，但是對(duì)萌發(fā)速度有明顯加快(10 d左右萌發(fā))。

表1 不同激素配方組合對(duì)誘導(dǎo)萌芽的影響

注：上.形成愈傷組織；下.正常萌發(fā)圖3 在培養(yǎng)基上萌發(fā)的種子

2.2 不同激素濃度對(duì)黃精的繼代增殖影響

在繼代增殖過(guò)程中，主要考慮細(xì)胞分裂素(6-BA)對(duì)芽增殖影響，生長(zhǎng)素NAA固定濃度0.2 mg·L-1配合使用。在啟動(dòng)獲得無(wú)菌外植體成功后，將帶有萌芽的球莖切成0.2 cm左右大小接種于設(shè)計(jì)的6組繼代增殖培養(yǎng)基中，25 d后均可以產(chǎn)生叢生芽以達(dá)到增殖目的(圖4)。

圖4 多花黃精繼代苗

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的觀察和記錄，此培養(yǎng)過(guò)程中做的三次重復(fù)試驗(yàn)，每次接種芽數(shù)均為100個(gè)，(三次試驗(yàn)新芽數(shù)B1：133、128、135；B2：159、163、156；B3：202、205、198；B4：251、255、246；B5：256、261、266；B6：303、309、300；)每組激素濃度配方的三次新芽數(shù)相差均在±10個(gè)以內(nèi)，可以看出各組激素濃度對(duì)增殖影響的相對(duì)穩(wěn)定性，由此綜合統(tǒng)計(jì)得出表2。

表2 不同激素濃度對(duì)繼代增殖的影響

由表2可以看出，在黃精繼代增殖過(guò)程中，6-BA濃度相對(duì)提高，其增殖系數(shù)也相應(yīng)提高，當(dāng)濃度超過(guò)2.0時(shí)，表2中B5和B6配方增殖系數(shù)分別為2.6和3.0，均比B4(增殖系數(shù)為2.5)高，但在繼代過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)B5和B6組別繼代苗長(zhǎng)勢(shì)弱小明顯，不利于后面的生根壯苗培養(yǎng)，達(dá)不到優(yōu)質(zhì)種苗要求。

2.3 不同激素濃度對(duì)生根影響

在生根壯苗過(guò)程中，為更好促進(jìn)壯苗生根，培養(yǎng)基采用1/2MS，激素調(diào)節(jié)主要考慮生長(zhǎng)素對(duì)生根的影響，IBA和NAA均屬于生長(zhǎng)素，對(duì)生根有促進(jìn)作用，本次試驗(yàn)中，設(shè)計(jì)IBA/NAA比值為10∶1的6個(gè)不同梯度的生根壯苗配方(C1-C6)。接種培養(yǎng)40 d，根據(jù)試驗(yàn)過(guò)程觀察和記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3。

表3 不同濃度激素對(duì)生根影響

由表3可以看出，IBA濃度低于1.0，生根狀態(tài)良好，但是生根率較低。IBA濃度在1.0時(shí)，其生根率和生根狀態(tài)處于一個(gè)較佳狀態(tài)(圖5)，當(dāng)超出1.0濃度時(shí)候，生根率雖然略有提高，但每株根數(shù)太多，根須細(xì)小(圖5)，煉苗時(shí)候根須太多且過(guò)長(zhǎng)不方便移栽，根須弱導(dǎo)致吸附營(yíng)養(yǎng)能力不強(qiáng)，不利于提高室外煉苗的成活率。

注：上.正常生根苗；下.根須多細(xì)長(zhǎng)圖5 生根培養(yǎng)的組培苗

2.4 組培苗室外煉苗

在清洗好的生根苗(圖6)，選取3～8條根一組移栽100株，9條根以上一組移栽100株，移栽到煉苗杯中(沙子∶泥炭土=1∶1)，每10 d噴施1次營(yíng)養(yǎng)液，30 d后生長(zhǎng)穩(wěn)定(圖6)，通過(guò)觀察和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得出表4。

注：上.生根苗；下.煉苗圖6 黃精組培苗的煉苗移栽

根須數(shù)移栽株數(shù)成活株數(shù)成活率4～810095959條以上1007171

由表4看出，根數(shù)太多，不但在移栽過(guò)程中不方便操作，且其移栽成活率相對(duì)較低，為2.3中最佳生根配方選擇提供了佐證。

3 結(jié)論

在利用多花黃精根莖進(jìn)行離體組織培養(yǎng)過(guò)程中，其無(wú)菌體系建立存在困難，主要原因是地下根莖中微生物多，根莖本身也存在內(nèi)生菌[4]。因此，如何建立無(wú)菌培養(yǎng)體系是多花黃精快速繁殖系統(tǒng)首先要解決的難題。在研究中，成功的利用多花黃精種子作為外植體，通過(guò)種子表面滅菌，在提供幾種植物生長(zhǎng)激素的情況下，建立了多花黃精的增殖誘導(dǎo)、快速擴(kuò)增及生根培養(yǎng)和煉苗移栽體系。

在繼代增殖和生根過(guò)程中，添加的外源激素濃度與多花黃精組培快繁之間存在一定的關(guān)系，選擇合適的外源植物生長(zhǎng)激素的配比是關(guān)鍵。這與許多植物組培相關(guān)文章中提到的激素濃度對(duì)植物組培生產(chǎn)影響相一致[5-6]。本文試驗(yàn)中，得出多花黃精組培過(guò)程中，無(wú)菌培養(yǎng)誘導(dǎo)和繼代增殖的最佳培養(yǎng)基分別為：MS基本培養(yǎng)基附加6-BA(1.5 mg·L-1)，NAA(0.2 mg·L-1)，GA3(0.5 mg·L-1)和MS基本培養(yǎng)基附加6-BA(2.0 mg·L-1)，NAA(0.2 mg·L-1)；生根壯苗階段的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS基本培養(yǎng)基附加IBA(1.0 mg·L-1)，NAA(0.1 mg·L-1)。多花黃精組培瓶苗不能直接下地移栽種植，必須先經(jīng)過(guò)瓶外煉苗階段，用煉苗基質(zhì)進(jìn)行裝杯進(jìn)行煉苗30 d后才可以大田種植，本文試驗(yàn)中煉苗成活率達(dá)95%以上。本試驗(yàn)結(jié)果直接應(yīng)用于組培企業(yè)生產(chǎn)，可為規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)多花黃精種苗提供依據(jù)。

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