黃河三角洲野生檉柳接種管花肉蓯蓉研究△

侯蕾，王運(yùn)濤，范仲學(xué)，趙術(shù)珍，李長生，王興軍

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight屬于列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生寄生植物，分布于我國新疆南疆地區(qū)，2005年被藥典收載，作為肉蓯蓉藥材的基源植物之一，有補(bǔ)精血、益腎壯陽、潤腸通便之功效[1-2]。

為保護(hù)管花肉蓯蓉野生資源，滿足市場對管花肉蓯蓉的需求，從二十世紀(jì)初開始了管花肉蓯蓉人工接種技術(shù)的研究[3-6]。盡管有多地報(bào)道引種管花肉蓯蓉成功，但是未見異地完成生育周期的報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)于2014年在黃河三角洲野生檉柳上接種管花肉蓯蓉獲得成功[6]；接種成功的管花肉蓯蓉于2016年開花結(jié)籽。本文調(diào)查了黃河三角洲野生檉柳接種管花肉蓯蓉的接種率；并對接種成功的管花肉蓯蓉的品質(zhì)及種子質(zhì)量做了評價(jià)，以期為黃河三角洲引種管花肉蓯蓉的可行性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

Agilent 1100 HPLC 色譜儀，二極管陣列檢測器(DAD)，四元低壓梯度泵，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，自動進(jìn)樣器。乙腈為色譜純，水為二次重蒸水。松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品購自中國藥品生物制品鑒定所，純度大于98%。

試驗(yàn)在山東省昌邑市野生檉柳TamarixchinensisLour林進(jìn)行。土壤類型為鹽潮土，試驗(yàn)田土壤的水解性氮、有效磷、速效鉀含量分別為11.26、9.01和126 mg·kg-1，土壤呈堿性，pH值為8.76 。

1.2 方法

1.2.1 管花肉蓯蓉接種方法 管花肉蓯蓉的接種方法，按照野生檉柳生長的位置，距離檉柳主干約25 cm處，挖寬20 cm，深40 cm的溝；按照每667 m2120 g的種子重量播種。播種后回填土約20 cm，澆水；然后把所有的土回填并踩實(shí)[7]。

1.2.2 接種率計(jì)算方法 于接種溝上隨機(jī)挖取30穴，重復(fù)3次，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉植株即為接種成功；否則沒有成功。計(jì)算公式為：

1.2.3 松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品溶液的制備 精密稱取松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品適量，置棕色瓶中，加60%甲醇配制成濃度分別為0.5 mg·mL-1的混合液，搖勻，即可。

1.2.4 供試溶液的制備 精密稱取管花肉蓯蓉粉末(過60目篩)1.0 g，置100 mL棕色容量瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，浸泡0.5 h后超聲處理40 min，取出，冷卻后再次稱量，用60%甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液用0.2 μm微孔濾膜濾過，作為測定松果菊苷、毛蕊花糖苷的供試樣品。

1.2.5 松果菊苷和毛蕊花糖苷的色譜條件 色譜柱Capcell core C18(150×2.1 mm，2.7 mm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水洗脫，按乙腈-0.1%甲酸(10∶90)，7 min內(nèi)換成20∶80，保持8 min，甲醇-0.1%甲酸(10∶90)沖洗柱子5 min；體積流量為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL；檢測波長為330 nm；柱溫35 ℃；理論塔板數(shù)按松果菊苷峰計(jì)應(yīng)不低于3000，見圖1。

注：1.松果菊苷；2.毛蕊花糖苷圖1 松果菊苷對照品和毛蕊花糖苷對照品(A)和管花肉蓯蓉樣品(B)的HPLC圖

1.2.6 種子萌發(fā)率測定方法 種子用70%酒精消毒30 s后，0.1%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水洗滌3～5次，備用。取內(nèi)襯2層濾紙、直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿，先加入10 mg·L-1氟啶酮6 mL，隨后隨機(jī)取已消毒的種子100粒，放入其中，封口膜密封，置于25℃培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)，24 d后檢查結(jié)果，重復(fù)3次[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃河三角洲野生檉柳接種管花肉蓯蓉

接種率是衡量接種成功與否的重要指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)于2014年秋季在昌邑野生檉柳林接種管花肉蓯蓉，2015年春季調(diào)查接種率。由表1可知，不同試驗(yàn)小區(qū)的平均接種率為81.9%，其中最高的高達(dá)86.7%，最低的接種率也達(dá)到了78.9%。因此，以接種率為衡量指標(biāo)，黃河三角洲野生檉柳接種管花肉蓯蓉成功。2016年5月份觀察發(fā)現(xiàn)，部分管花肉蓯蓉已經(jīng)開花結(jié)實(shí)(圖2)，其花序的總長度可達(dá)90 cm，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，管花肉蓯蓉在黃河三角洲地區(qū)可以完成其生活史。

表1 黃河三角洲野生檉柳管花肉蓯蓉的接種率

圖2 管花肉蓯蓉花序

2.2 黃河三角洲野生檉柳接種的管花肉蓯蓉品質(zhì)分析

本研究對國家藥典規(guī)定的指標(biāo)性成分進(jìn)行了測定(表2)。結(jié)果表明，黃河三角洲野生檉柳接種的管花肉蓯蓉松果菊苷和毛蕊花糖苷含量分別為16.5%和5.6%，兩者含量之和為22.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于藥典規(guī)定的不少于1.5%[9]。因此，黃河三角洲野生檉柳接種的管花肉蓯蓉的指標(biāo)成分含量符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。對管花肉蓯蓉干片進(jìn)行含水量和浸出物分析，結(jié)果表明，含水量為6.7%，稀乙醇浸出物含量為32.6%。

表2 黃河三角洲鹽堿地生產(chǎn)的管花肉蓯蓉指標(biāo)性成分含量

2.3 黃河三角洲野生檉柳接種管花肉蓯蓉的種子質(zhì)量分析

黃河三角洲野生檉柳成功接種管花肉蓯蓉，接種成功并不代表引種成功。只有其能完成生活史，實(shí)現(xiàn)自我繁殖，才能稱為引種成功。因此，本研究對黃河三角洲野生檉柳接種的管花肉蓯蓉種子的發(fā)芽率進(jìn)行了測定，萌發(fā)率在46～63%之間。因此，黃河三角洲野生檉柳接種管花肉蓯蓉能實(shí)現(xiàn)自我繁殖。

3 討論和結(jié)論

3.1 黃河三角洲鹽堿地成功引種管花肉蓯蓉

管花肉蓯蓉是否能異地種植一直是肉蓯蓉專家探討的一個(gè)問題。一些專家認(rèn)為，管花肉蓯蓉可以異地種植，依據(jù)是管花肉蓯蓉在內(nèi)蒙古、河北省和山東省接種成功[4，5]；另一些專家則持不同的觀點(diǎn)，依據(jù)是管花肉蓯蓉種植到異地后，未見完成生活史的報(bào)道，相反，有異地引種接種的管花肉蓯蓉腐爛現(xiàn)象比新疆道地產(chǎn)區(qū)腐爛現(xiàn)象嚴(yán)重的報(bào)道[10]。本文作者認(rèn)為，首先應(yīng)該把接種成功和引種成功區(qū)分開：只要接種后肉蓯蓉的接種率高，就可以認(rèn)為接種成功。但是，因?yàn)槿馍惾貨]有完成生活史，不能稱為引種成功。引種成功不僅要有高的接種率，而且肉蓯蓉能夠在引種地完成其生活史。

本研究結(jié)果中，黃河三角洲野生檉柳挖溝法接種管花肉蓯蓉有較高接種率與前人的研究結(jié)果相似[4-5]，說明黃河三角洲鹽堿地野生檉柳接種肉蓯蓉成功。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明了，黃河三角洲檉柳生產(chǎn)的管花肉蓯蓉能夠完成生活史，從而證明了黃河三角洲鹽堿地成功引種管花肉蓯蓉。

3.2 黃河三角洲野生檉柳生產(chǎn)的管花肉蓯蓉指標(biāo)成分符合藥典要求

黃河三角洲鹽堿地成功引種管花肉蓯蓉，為管花肉蓯蓉種質(zhì)資源異地保存奠定了基礎(chǔ)。本研究測定了黃河三角洲生產(chǎn)的肉蓯蓉的指標(biāo)性成分的含量。結(jié)果表明，松果菊苷和毛蕊花糖苷含量之和遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥典要求。因此，黃河三角洲野生檉柳生產(chǎn)的管花肉蓯蓉指標(biāo)性成分符合國家藥典要求。本文的研究結(jié)果表明，黃河三角洲鹽堿地野生檉柳接種管花肉蓯蓉的接種率高、品質(zhì)好并且能完成自我繁殖。因此，利用黃河三角洲鹽堿地野生檉柳接種和生產(chǎn)管花肉蓯蓉是可行的。

山東省濰坊市昌邑北部沿海地帶的黃河三角洲萊州灣分布有天然檉柳林2000多公頃，是我國唯一以檉柳為主要保護(hù)對象的國家級海洋生態(tài)特別保護(hù)區(qū)，但是受自然因素和人為干擾的影響，檉柳林分質(zhì)量不斷下降，低效檉柳林面積逐步擴(kuò)大[11]。該地區(qū)天然檉柳林成功接種管花肉蓯蓉，實(shí)現(xiàn)以藥養(yǎng)林，為本地區(qū)建設(shè)檉柳林示范區(qū)及國家級海洋生態(tài)保護(hù)區(qū)提供了新思路。

[1] 王文采，潘開玉，張志耘.中國植物志：第69卷[M].北京：科學(xué)出版社，1990：82-89.

[2] 田海舟，趙忠久，周新和，等.管花肉蓯蓉生物學(xué)特性研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科技，2004(5)：34-35.

[3] 劉銘庭，劉兵，劉軍.紅柳大蕓人工栽培與推廣∥第二屆肉蓯蓉暨沙生藥用植物學(xué)術(shù)研討會論文集[C].中國藥學(xué)會，2002.

[4] 李天然，曹瑞，馬虹，等.管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa)在內(nèi)蒙古栽培成功[J].中國野生植物資源，2002，21(5)：54.

[5] 楊太新，杜艷華，劉金娜，等.管花肉蓯蓉不同生長時(shí)間和部位的有效成分含量分析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014(5)：1191-1193.

[6] 王運(yùn)濤，王興軍.山東省東營檉柳接種管花肉蓯蓉獲得成功[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，47(8)：157-157.

[7] 屠鵬飛，陳慶亮，姜勇，等.管花肉蓯蓉及其寄主檉柳栽培技術(shù)[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(4)：349-358.

[8] Chen Q L，Jiang Y.A convenient and accurate seed germination assay for root parasitic plants[J].SEED SCI TECHNOL，2016，44(1)：2012-217.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：126.

[10] 楊太新，王華磊，郭玉海，等.華北平原管花肉蓯蓉寄生環(huán)境研究[J].中國中藥雜志，2005，30(17)：1380-1383.

[11] 夏江寶，劉玉亭，朱金方，等.黃河三角洲萊州灣檉柳低效次生林質(zhì)效等級評價(jià)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24(6)：1551-1558.