五味子油超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其護(hù)肝作用

王小寧 - 郝 晶 劉子晨 - 閆夢(mèng)茹 - 張存勞 -

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

肝損傷是常見(jiàn)的臨床疾病之一。中國(guó)是肝病大國(guó)，多種急慢性肝病在中國(guó)均有較廣分布，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。近年來(lái)，從植物中提取天然性成分護(hù)肝成為研究的熱點(diǎn)[2]。五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功能[3]。研究[4-5]表明，五味子對(duì)化學(xué)性、藥物性、酒精性等不同類型的肝損傷具有不同程度的保護(hù)作用。白慧媛等[6]研究了五味子對(duì)氯氮平致小鼠肝損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，五味子能減輕肝細(xì)胞的損傷，降低由氯氮平引起的AST和ALT增高。張錦楠等[7]的研究表明五味子果汁可以顯著提高大鼠肝微粒體CYP450水平，增強(qiáng)肝臟代謝功能。汪麗君等[8]研究表明，五味子中的木脂素成分(包括五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等)具有改善肝功能、減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的作用，是保肝作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。丁傳波等[9]從五味子藤莖中提取的木脂素能夠有效緩解CCl4造成的小鼠急性肝損傷，其高劑量組的改善作用與聯(lián)苯雙酯相近。宋影影等[10]對(duì)五味子籽壓榨油的成分及對(duì)酒精肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究，但關(guān)于五味子種籽油的提取工藝及種籽油對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以五味子種籽為原料，用單因素和正交試驗(yàn)篩選最優(yōu)種籽油的超聲輔助提取工藝，高效液相色譜法分析其中木脂素成分的含量，并考察五味子種籽油對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，為五味子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

五味子：北五味子，陜西鎮(zhèn)安瑞琪藥材有限公司；

昆明白小鼠：SPF級(jí)，中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品：純度99.46%，成都曼斯特生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、正己烷、石油醚、四氯化碳：分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司；

花生油：壓榨一級(jí)，山東魯花集團(tuán)有限公司；

GSH、MDA、SOD試劑盒：南京建成科技有限公司；

肝泰樂(lè)：每片100 mg，北京太洋藥業(yè)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

萬(wàn)分之一電子分析天平：ALC-210.4型， 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200E型，昆山市超聲儀器有限公司；

低速大容量離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器制造廠；

高效液相色譜儀：Agilent Tech-1260型，安捷倫科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R201L型，上海申生科技有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan Go型，賽默飛世爾科技有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度儀：CARY-60型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2 五味子籽仁油超聲輔助提取工藝的優(yōu)化

1.2.1 五味子種籽的前處理 將干燥的五味子果實(shí)放入80 ℃ 的熱水中浸泡2 h，搓出種籽去除果肉并清洗干凈，陰干，將適量五味子種籽粉碎過(guò)16目篩，備用。

1.2.2 五味子種籽油的提取及提油率的測(cè)定 精密稱取粉碎后的已稱重五味子種籽(記為m)加入100 mL錐形瓶中，加入提取溶劑，超聲一定時(shí)間。取一已稱重(記為m1)的干燥潔凈的圓底燒瓶，將提取得到的溶液抽濾后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得五味子種籽油，并將燒瓶和油稱重，記為m2，提油率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

ER——提油率，%；

m1——燒瓶和油總質(zhì)量， g；

m2——燒瓶質(zhì)量， g；

m——五味子種籽的質(zhì)量，g。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

(1) 單因素試驗(yàn)：以提油率為指標(biāo)，依次考察溶劑種類(無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、正己烷)、料液比[1∶10，1∶12，1∶15，1∶18，1∶20 (g/mL)]、提取時(shí)間(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h)、提取溫度(20，30，40，50，60 ℃)、超聲功率(40,60,80,100,120 W)5個(gè)因素對(duì)提油率的影響。當(dāng)選定某一因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，其余各個(gè)因素的條件為：提取溶劑為正己烷，料液比1∶15 (g/mL)，提取時(shí)間2 h，提取溫度30 ℃，超聲功率80 W。

(2) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提油率為考察指標(biāo)，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

1.2.4 五味子種籽油中木脂素含量的測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定木脂素含量，測(cè)定方法根據(jù)文獻(xiàn)[11]修改如下：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別制備57.00 μg/mL的五味子甲素對(duì)照液、26.25 μg/mL的五味子乙素對(duì)照液、4.80 μg/mL的五味子醇甲對(duì)照液，各精密吸取上述3份對(duì)照品液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 mL 于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得一系列濃度的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液20 μL注入高效液相色譜儀，色譜條件為：Diamond C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-水(體積比為80∶20)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃。記錄色譜圖，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算樣品中木脂素的含量。

1.3 保肝作用及機(jī)制研究

1.3.1 試驗(yàn)分組 昆明白小鼠48只，體重18～22 g，隨機(jī)分為6組，每組8只，雌雄各半。試驗(yàn)分組：五味子種籽油高劑量組(五味子種籽油2 g/kg)、中劑量組(五味子種籽油1 g/kg)、低劑量組(五味子種籽油0.5 g/kg)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(肝泰樂(lè)5.7 mg/mL)、肝損傷模型組以及正常對(duì)照組。

1.3.2 試藥的配制

(1) 0.2% CCl4花生油溶液的配制：精密量取CCl40.2 g于100 mL燒杯中，加花生油定容，得0.2% CCl4花生油溶液。

(2) 24 mg/mL肝泰樂(lè)混懸液的配制：取肝泰樂(lè)片劑20片(重量為1.427 g)，研成細(xì)粉。精密稱取肝泰樂(lè)粉末342.5 mg于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，用前充分搖勻，得濃度為5.7 mg/mL的藥物溶液。

(3) 五味子種籽油花生油溶液的配制：分別稱取五味子種籽油2.0，1.0，0.5 g于10 mL容量瓶中，加入花生油定容，搖勻，得濃度分別為200，100，50 mg/mL的五味子種籽油花生油溶液。

1.3.3 肝損傷模型的建立 在人工控制晝夜12 h，溫度20.3～23.1 ℃，壓差20 Pa(進(jìn)風(fēng)180 Pa，出風(fēng)160 Pa)，相對(duì)濕度40%～60%的飼養(yǎng)條件下，先將小鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，然后進(jìn)行連續(xù)7 d的給藥，于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液造肝損傷模型，灌喂量為第1、7天10 mL/kg，第4天為5 mL/kg。

1.3.4 給藥方案

(1) 五味子種籽油高、中、低劑量組給藥方法：分別每天灌喂200，100，50 mg/mL五味子種籽油花生油溶液，灌喂量為10 mL/kg，按10 mL/kg灌喂蒸餾水作為空白組，并于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(2) 陽(yáng)性藥物對(duì)照組給藥方法：每天灌喂24 mg/mL肝泰樂(lè)混懸液10 mL/kg，每次灌喂時(shí)充分搖勻，同時(shí)灌喂花生油10 mL/kg作為對(duì)照，并于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(3) 肝損傷模型組：每天灌喂花生油10 mL/kg、蒸餾水10 mL/kg作對(duì)照，并于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(4) 正常對(duì)照組：每天灌喂花生油10 mL/kg，蒸餾水10 mL/kg，并于給藥的第1、4、7天補(bǔ)灌其他組0.2% CCl4花生油溶液等量的花生油。

1.3.5 組織勻漿制備 最后一次灌喂CCl4，16 h后將小鼠斷頸處死取出肝臟，于0.9%生理鹽水中清洗去除剩余血液，切一小部分稱重，按1∶9 (g/mL)比例加入生理鹽水，在冰水浴中勻漿，充分勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.6 谷胱甘肽(GSH)含量測(cè)定 采用微量酶標(biāo)法。通過(guò)谷胱甘肽還原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG[12]。于405 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算GSH含量。

1.3.7 丙二醛(MDA)含量測(cè)定 過(guò)氧化物脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色復(fù)合物，分光光度計(jì)532 nm處比色，計(jì)算MDA含量[12]。

1.3.8 超氧化歧化酶(SOD)活性測(cè)定 黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，后者氧化羥氨形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，而SOD則抑制此反應(yīng)，分光光度計(jì)550 nm處比色，計(jì)算SOD活性[13]。

1.3.9 肝臟病理檢測(cè) 將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，制成4 m石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，再進(jìn)行梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來(lái)。最后滴加中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 溶劑種類對(duì)五味子種籽油提取率的影響 圖1結(jié)果表明，以正己烷為溶劑時(shí)五味子種籽油的提取率最高，因此選定正己烷為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 溶劑種類對(duì)提油率的影響Figure 1 Effect of solvent types on extraction rate of seed oil

2.1.2 料液比對(duì)五味子種籽油提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)溶劑達(dá)到飽和量后，提油率不再上升，繼續(xù)增加溶劑量只會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)，因此，選定料液比為1∶15 (g/mL)進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 料液比對(duì)提油率的影響Figure 2 Effect of the ratio of solid to liquid on extraction rate of seed oil

2.1.3 超聲功率對(duì)五味子種籽油提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增大，提油率逐漸增大，但當(dāng)超聲功率達(dá)到一定限度后，提油率下降。推測(cè)原因是超聲功率過(guò)大，使得很多無(wú)效成分被提出，這些成分對(duì)油可能具有吸附作用，使油難以被提出。選擇超聲功率80 W進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 超聲功率對(duì)提油率的影響Figure 3 Effect of the ultrasonic power on extraction rate of seed oil

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)五味子種籽油提取率的影響 由圖4可知，超聲時(shí)間對(duì)提油率影響較明顯，但當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)一定限度后，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間提油率不再上升，因此選擇提取時(shí)間為2 h進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提油率的影響Figure 4 Effect of the extraction time on extraction rate of seed oil

2.1.5 提取溫度對(duì)五味子種籽油提取率的影響 由圖5可知，在整個(gè)溫度范圍內(nèi)，五味子種籽油的提取率變化不大，從提油率結(jié)果和實(shí)際應(yīng)用角度考慮，選擇40 ℃為最優(yōu)提取溫度。

圖5 提取溫度對(duì)提油率的影響Figure 5 Effect of the temperature on extraction rate of seed oil

2.1.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素篩選得到的最優(yōu)條件，以料液比、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度為因素，建立四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析表見(jiàn)表3。

由表2可知，影響超聲提取五味子種籽油提取效果的因素排序?yàn)锽>A>D>C；由方差分析結(jié)果可知，超聲功率對(duì)提油率具有顯著影響(P<0.05)；最佳的工藝條件為A3B3C2D3，即料液比1∶18 (g/mL)、超聲功率80 W、提取時(shí)間2 h、提取溫度50 ℃。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 L9(34) orthogonal test and data processing

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.1.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 精密稱取2 g同一批五味子種籽3份，分別置于3個(gè)錐形瓶中，按上述最優(yōu)提取工藝，得到提油率分別為29.86%，30.0%，29.95%，平均提油率為29.94%，RSD值為0.25%，提取率高，工藝穩(wěn)定。五味子種籽油中五味子甲素含量為4.00%，五味子乙素含量為1.95%，五味子醇甲含量為0.13%，與文獻(xiàn)[14]中報(bào)道的數(shù)據(jù)相比，木脂素總含量高于五味子果實(shí)，具有較高的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。

2.2 護(hù)肝作用研究

2.2.1 五味子種籽油對(duì)小鼠肝組織GSH、SOD及MDA活性的影響 CCl4在肝細(xì)胞色素P450氧化酶作用下，生成CCl3·和Cl·，CCl3·導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，被認(rèn)為是引發(fā)肝損傷的主要機(jī)制[15]。自由基過(guò)度累積會(huì)引起細(xì)胞膜完整性和功能的喪失。SOD和GSH-Px是組成生物體體內(nèi)酶促防御體系重要的抗氧化酶，它們能有效地清除活性氧自由基并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[16]。當(dāng)肝細(xì)胞受到自由基攻擊時(shí)，SOD、GSH會(huì)因過(guò)度消耗而逐漸減少。MDA是體內(nèi)自由基攻擊脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝終產(chǎn)物，MDA水平的高低可以反映細(xì)胞氧化損傷的程度[17]。由表4可知，與空白對(duì)照組比較，肝損傷模型組小鼠肝組織GSH和SOD水平顯著降低(P<0.01)，MDA水平顯著升高(P<0.01)，表明CCl4肝損傷模型造模成功，小鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激增加。與肝損傷模型組比較，五味子種籽油低、中、高劑量和肝泰樂(lè)保肝藥均可顯著降低肝組織MDA含量(P<0.01)，升高SOD和GSH水平(P<0.01)，提示五味子種籽油可顯著改善小鼠肝臟的氧化應(yīng)激狀況，推測(cè)其保護(hù)作用的機(jī)制是通過(guò)清除氧自由基實(shí)現(xiàn)的。

2.2.2 五味子種籽油對(duì)小鼠肝臟病理形態(tài)的影響 由圖6可知，空白對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞條索排列規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)均勻紅染，細(xì)胞核清晰，未見(jiàn)明顯腫脹變性，枯否氏細(xì)胞分布均勾，未見(jiàn)周圍大量聚集[圖6(a)]。CCl4模型組肝小葉界限模糊，肝細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞輪廓模糊，肝上皮細(xì)胞細(xì)胞核濃縮、溶解，有一些大片狀肝細(xì)胞壞死灶[圖6(b)]。陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常[圖6(c)]，細(xì)胞輪廓較為清晰。低劑量組肝細(xì)胞形態(tài)較為正常，但仍有部分干細(xì)胞輪廓模糊，門管區(qū)仍能觀測(cè)到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[圖6(d)]；中、高劑量組大多數(shù)肝臟結(jié)構(gòu)較CCl4模型組恢復(fù)明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密，肝細(xì)胞形態(tài)基本接近于空白對(duì)照組，肝竇恢復(fù)正常，肝索呈放射狀排列[圖6(e)、(f)]。

表4 SOD、MDA、GSH含量測(cè)定結(jié)果?Table 4 Results of SOD, MDA, GSH content

? a. 與正常對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)；b. 與肝損傷模型組相比，差異顯著(P<0.05)；c. 與肝損傷模型組相比，差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)五味子種籽油的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得最佳提取工藝為：料液比1∶15 (g/mL)、超聲功率80 W，提取時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明工藝穩(wěn)定，提油率高。HPLC法分析五味子種籽油中木脂素成分的含量，得五味子甲素含量為4.00%，五味子乙素含量為1.95%，五味子醇甲含量為0.13%。保肝試驗(yàn)結(jié)果表明，五味子種籽油高、中、低劑量組均可顯著降低肝組織MDA含量(P<0.05或P<0.01)，升高SOD和GSH水平(P<0.01)，說(shuō)明五味子種籽油可顯著改善小鼠肝臟的氧化應(yīng)激狀況。HE染色結(jié)果顯示五味子種籽油可改善小鼠肝細(xì)胞水腫、壞死，修復(fù)肝損傷。與肝功能相關(guān)的血液生化學(xué)指標(biāo)的變化及超聲輔助提取工藝的中試放大試驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。

[1] 彭飛, 林麗, 熊瑞芳. 肝損傷機(jī)制的研究[J]. 科技資訊, 2012(33): 236-237.

[2] 隋菱, 鄭靜彬, 蔡國(guó)弟, 等. 姜黃素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性肝損害的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2017, 34(11): 1 517-1 521.

[3] 劉宇靈, 付賽, 樊麗姣, 等. 南北五味子化學(xué)成分、藥理作用等方面差異的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(12): 228-234.

[4] 王春梅, 李賀, 李生, 等. 北五味子木脂素對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(13): 262-265.

[5] 孔華麗, 閆亮, 段惠娟. 五味子醇提取物保肝作用成分分析[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(1): 27-29, 62.

[6] 白慧媛, 俸珊. 五味子乙素對(duì)氯氮平致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 52(3): 390-396.

[7] 劉長(zhǎng)姣, 于徊萍, 孟憲梅, 等. 五味子果汁對(duì)四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(18): 355-369.

[8] 汪麗君, 劉淑敏, 毛春芹, 等. 一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定五味子中8個(gè)木脂素類成分的含量[J]. 藥物分析雜志, 2015, 35(7): 1 191-1 197.

[9] 丁傳波, 劉群, 董嶺, 等. 五味子藤莖中木脂素和多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2014, 29(6): 648-650.

[10] 宋影影, 馮婷婷, 李洪發(fā), 等. 五味子籽壓榨油中3種木脂素含量的測(cè)定及對(duì)酒精肝損傷的保護(hù)作用研究[J]. 延邊大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2014, 40(4): 328-331.

[11] 王建花. 高效液相色譜法測(cè)定參芪降糖顆粒中五味子甲素、五味子乙素含量[J]. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用, 2016, 10(18): 289-291.

[12] CHECKER R, PATWARDHAN R S, SHARMA D, et al. Schisandrin B exhibits anti-inflammatory activity through modul-ation of the redox-sensitive transcription factors Nrf2 and NF-kB[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2012, 53(7): 1 421-1 430.

[13] TOORI M A, JOODI B, SADEGHI H, et al. Hepatoprotective activity of aerial parts of Otostegia persica against carbon tetrachlorideinduced liver damage in rats[J]. Avicenna Journal of Phytomed, 2015, 5(3): 238-246.

[14] 王慧竹, 楊英杰, 關(guān)銘, 等. 五味子果實(shí)、藤莖及藤皮的木質(zhì)素成分分析[J]. 吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 28(9): 32-34.

[15] 王建青. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急慢性肝損傷中的作用及部分機(jī)制[D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2012.

[16] 周瓊, 劉芳萍, 劉穎姝, 等. 四氯化碳致小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型建立方法的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 43(6): 77-81.

[17] JUNG J C, LEE Y H, KIM S H, et al. Hepatoprotective effect of licorice, the root of lycyrrhiza uralensis, Fischer, in alcohol-induced fatty liver disease[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2015, 16(1): 1-10.