生物活性陶瓷、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、醫(yī)用生物蛋白膠復合物誘導成骨活性研究

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山東省濟寧市第二人民醫(yī)院骨科,濟寧 272049

隨著創(chuàng)傷性骨缺損及各種骨病刮除病灶后遺留骨缺損的日益增多,骨缺損的修復重建成為骨科常見的課題,也是難題之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)能夠誘導動物或人體間充質(zhì)細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織[1]。本研究用陶瓷人工骨、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物進行誘導成骨試驗,通過大體標本、病理組織學觀察及堿性磷酸酶活性檢測,與單純使用陶瓷人工骨進行對比,以探討復合載體復合誘導因子的誘導成骨作用是否優(yōu)越及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 病例選擇、分組

選純種SD大鼠20只,雌雄不限,體質(zhì)量(200±20)g,隨機分為A、B、C 3組,每組10只,觀察4周。每組10只分為2組,每組5只,第1組(試驗組)、第2組(對照組)。

1.2 復合物制備

將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液、纖維蛋白原溶液、陶瓷人工骨按1∶1∶1比例放入玻璃容器,攪拌,充分混合后,置于37 ℃恒溫箱中保溫1 h,充分反應,即得陶瓷人工骨、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及纖維蛋白復合物。

1.3 手術過程

大鼠用0.25%硫賁妥鈉腹腔注射麻醉,將雙腿剃毛,酒精消毒,切開股后肌群,分離出肌袋,按表1分別植入相應復合物,縫合各層,放入籠中飼養(yǎng)。

1.4 術后處理

每只大鼠每日肌注青霉素4萬單位,連注3 d,4周檢測。

1.5 大體標本肉眼觀察植入物的大小、硬度、血管分布情況

各組動物于相應時間點用脫臼法處死,觀察植入物的大小、硬度、血管分布情況。測量并記錄植入物的直徑,記錄血管長入情況,并記錄硬度。

1.6 術后植入物組織學觀察

在設定的時間點處死動物,取出標本,每組5個標本用10%甲醛中性液固定,常規(guī)脫鈣、脫水、石蠟包埋,5 μm連續(xù)切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察。

1.7 術后植入物堿性磷酸酶活性測定

每組取5個標本,稱量濕重,加入1 mL生理鹽水,用電動勻漿機進行勻漿,4 000 r/min,15分鐘離心后去上清液,用ALP試劑盒在Olympus AU800全自動生化分析機上進行活性檢測,其結果除以濕重,即得ALP含量(U/g)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理后采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件。組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗分析方法進行統(tǒng)計分析。

2 實驗結果

2.1 大體標本肉眼觀察植入物的大小、硬度、血管分布情況

植入陶瓷人工骨、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物(A)及陶瓷人工骨(B)大體標本肉眼觀察植入物的大小、硬度、血管分布結果,有效組植入物直徑均超過3 mm,有大量骨樣組織沉積,質(zhì)地較硬,并可見大量血管長入,數(shù)據(jù)見表1。

2.2 術后植入物組織學觀察

光鏡下標本組織學觀察,植入陶瓷人工骨、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物(A)及陶瓷人工骨(B)標本組織學觀察數(shù)據(jù),有效組移植物內(nèi)有大量骨細胞出現(xiàn),無效組移植物內(nèi)軟骨細胞、類骨質(zhì)較多,骨細胞較少,結果見表2,圖1～3。

表1 大鼠植入物大小、硬度、血管分布情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.1 Size, hardness, and vascularity of implantation materials in rats

表2 各組大鼠植入物的組織生長情況Tab.2 Tissue growth of implantation materials in rats of each group

A:1周;B,C:2周

2.3 術后植入物堿性磷酸酶活性測定

植入陶瓷人工骨、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物(A)及陶瓷人工骨(B)標本堿性磷酸酶活性測定數(shù)據(jù)見表3。

3 討論

骨病和創(chuàng)傷引起的骨缺損或功能障礙是危害人類健康的主要原因之一[1-4]。目前,各種骨缺損最行之有效的治療方法為骨移植。

3.1 骨移植修復理論

骨移植修復目前主流理論有5個概念:(1)直接愈合;(2)混合愈合;(3)爬行替代;(4) 傳導成骨;(5)誘導成骨[5]。Taylor等[6]1975年首次將血管化自體骨移植應用于臨床并取得成功。研究發(fā)現(xiàn),包括轉化生長因子在內(nèi)的多種生長因子均參與骨修復過程[7-8]。

3.2 陶瓷人工骨、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物的骨誘導作用

生物陶瓷具有優(yōu)良的生物相容性能和臨床應用價值。研究發(fā)現(xiàn),孔徑大于100 μm的多孔陶瓷才能為組織內(nèi)生長增殖提供必要營養(yǎng)[9]。由此可見,材料的生物學特性受孔徑尺寸與形狀的直接影響。同時,人骨結構與成分是介于磷石和磷酸鈣之間的物質(zhì)。陶瓷人工骨無論是成分還是結構都與人骨相似。

BMP是一種生長分化因子,可誘導成骨修復骨缺損,誘導間質(zhì)細胞分化為骨或軟骨[10]。Simank等[11]建立羊股骨頭壞死模型,將含BMP-2的血凝塊植入壞死區(qū)域,結果發(fā)現(xiàn)實驗組與單純植入血凝塊組相比,有明顯的骨形成。

醫(yī)用生物蛋白膠(纖維蛋白封閉劑)是從血液中提取相關成分(纖維蛋白原、ⅩⅢ因子、凝血酶等),模擬人體凝血機制的最后階段,最終形成乳白色凝膠物。Bosch等[12]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)覆蓋纖維蛋白膠的骨皮質(zhì)缺損,其毛細血管和結締組織以較快速度生長。骨形態(tài)發(fā)生蛋白制成骨修復材料保證骨形態(tài)發(fā)生蛋白穩(wěn)定性,提高其誘導成骨能力[13]。

3.3 陶瓷人工骨、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復合物在治療骨缺損的應用

長期以來,骨缺損修復一直是骨科臨床亟待解決的難題。目前,骨移植為解決這一難題帶來希望,修復效果顯著,但移植骨材料來源有限、存在二次手術創(chuàng)傷、術后易出現(xiàn)感染、免疫排斥反應等問題。大量實驗研究已證實BMP具有誘導骨形成和促進骨缺損修復的作用,故將BMP應用于臨床治療骨缺損已提上日程。骨移植為解決這一難題帶來希望,修復效果顯著,但具有一定局限性[14]。BMP移植需要有適宜載體才能發(fā)揮作用。有研究表明,絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石生物支架可持續(xù)緩慢釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白[15-16]。 Ruhe等[17]將BMP/磷酸鈣骨水泥、磷酸鈣骨水泥、BMP/膠原海綿分別植入兔顱骨骨缺損區(qū),觀察到BMP/磷酸鈣骨水泥組在機械強度、骨傳導性和新骨形成方面的效果明顯優(yōu)于其他兩組。李建軍等[18]將轉染BMP-2基因的骨髓基質(zhì)干細胞(MSC)與聚乳酸/聚己內(nèi)酯(PLA/PCL)支架復合以修復兔橈骨缺損,取得預期效果。

表3 大鼠組織堿性磷酸酶活性Tab.3 Alkaline phosphatase activities in rats

陶瓷人工骨可發(fā)揮支架及骨傳導作用,纖維蛋白作為生物黏合劑,可將BMP黏合于陶瓷人工骨,作為復合載體,發(fā)揮雙重誘導作用,效果顯著,因此該復合物是較為理想的骨移植修復材料。

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