圣·約翰草提取物片對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型小鼠恐懼和焦慮行為的改善作用

文 浩，劉謙東，李碩碩，周陸軍，樊雙義

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍307臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100071；2.日照市人民醫(yī)院急診科，山東日照 276800；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指個體經(jīng)歷或目睹自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭、車禍或性侵等威脅生命的重大突發(fā)事件后延遲出現(xiàn)的精神癥狀［1］。主要有以下4類表現(xiàn)：侵入性癥狀（對痛苦事件的不斷回憶及噩夢）、逃避行為（刻意回避引起創(chuàng)傷事件的情景和刺激）、消極的情感狀態(tài)（愧疚、自責(zé)）和易激惹狀態(tài)（易受驚嚇、易興奮）［2］。近年來，PTSD患病率隨社會突發(fā)事件的增多而升高。有研究表明，經(jīng)歷應(yīng)激事件之后，PTSD的終生患病率為6%～9%［3］，部分PTSD患者還有明顯的自殺傾向［4］，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［5-6］。目前，PTSD的治療以藥物干預(yù)和心理治療為主，選擇性5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI） 如 舍 曲 林（sertraline）和帕羅西汀，常作為臨床治療PTSD的一線藥物，有一定療效，但因其副作用較多［7］，費用比較昂貴，患者依從性較差，常常達(dá)不到理想的效果［8-9］。因此，尋找安全有效的藥物治療PTSD具有重大的臨床意義。

貫葉連翹（Hypericum perforatum），又名圣·約翰草（St.John′s wort，SJW），屬藤黃科金絲桃屬植物，SJW提取物片（extract of SJW tablets，ESJWT）主要有效成分為金絲桃素和貫葉金絲桃素（含量不低于總量的3%），具有多重抗抑郁作用，能有效抑制突觸間隙5-HT、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA）的重吸收［10］，臨床上常用于焦慮、抑郁患者的治療，目前已取得了確切的療效［11］；同時還具有抗炎和止痛作用［12-13］。治療焦慮和抑郁時，ESJWT與SSRI類藥物療效相當(dāng)，并且具有安全性高、副作用小和經(jīng)濟實惠等優(yōu)點［14-15］，但目前尚無應(yīng)用于PTSD治療的報道。因此，本研究通過短暫電擊制備的PTSD模型小鼠，觀察ESJWT對PTSD模型小鼠焦慮和恐懼行為的作用，同時檢測小鼠血清NE和5-HT水平的變化，探討ESJWT抗PTSD的作用，為臨床防治PTSD提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

ESJWT片（商品名：路優(yōu)泰，進口藥品注冊證號：Z20090005，德國威瑪舒培博士藥廠，每300 mg提取物中，貫葉金絲桃素含量≥9 mg，總金絲桃素含量≥0.4 mg），將ESJWT片常規(guī)粉碎，使用相應(yīng)體積生理鹽水混勻放入均質(zhì)器進行振蕩，按小鼠平均體質(zhì)量配置成6 g·L-1的混懸液，放入4℃冰箱備用；鹽酸舍曲林片（國藥準(zhǔn)字：H10980141，輝瑞制藥有限公司）。小鼠NE和5-HT ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司）。

LE104E/02電子天平（上海METTLER TOLED有限公司）；DW-40L508醫(yī)用低溫（-80℃）保存箱（中國海爾公司）；Precellys均質(zhì)器（法國Bertin Technologies公司）；Microfuge 20R高速冷凍離心機（美國 Beckman Coulter公司）；Spark 10M多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；動物行為學(xué)分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）。

1.2 實驗動物、分組和給藥

雄性C57BL/6小鼠48只，SPF級，8～10周齡，體質(zhì)量20～28 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。實驗前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每籠5～6只，溫度20～24℃，濕度40%～60%，人工控制晝夜節(jié)律光線，小鼠自由進食、飲水。將所有小鼠隨機分為4組，每組12只，分別為正常對照組（生理鹽水，ig），模型組（生理鹽水，ig），舍曲林治療組（15 mg·kg-1，ig），ESJWT治療組（25 mg·kg-1，ig），其中ESJWT治療組所用藥物劑量參考程啟潤等［16］貫葉連翹提取物相關(guān)治療的最低有效劑量。所有小鼠每天給藥1次，每次實驗前1 h給藥，持續(xù)到實驗結(jié)束。

1.3 PTSD模型小鼠的制備

適應(yīng)飼養(yǎng)過程中每天輕抓、撫摸小鼠2～3次，建模前1 h給予小鼠藥物處理，每天1次，并提前1 h置于實驗室適應(yīng)環(huán)境，減少實驗中的應(yīng)激反應(yīng)。參考姬雅君等［17］PTSD小鼠建模方法，連續(xù)2 d給予C57BL/6小鼠足底不可逃避的電流刺激（電擊箱適應(yīng)5 min，電流0.8 mA，，電擊15次，間隔10 s，持續(xù)10 s）；正常對照組小鼠置于電擊箱中10 min，不給予任何刺激。實驗過程中無小鼠死亡。

1.4 小鼠體質(zhì)量測定

第1，7，13和19天測定小鼠體質(zhì)量，觀測小鼠體質(zhì)量在實驗過程中的變化。

1.5 小鼠行為學(xué)實驗

1.5.1 僵住實驗

第3，8和15天，將所有藥物處理小鼠在實驗室環(huán)境下適應(yīng)1 h，分別放入電擊箱中自由活動5 min，不給予任何刺激，記錄其僵住時間百分比（除呼吸外其他肌肉活動消失的時間/總實驗時間），該指標(biāo)主要反映小鼠重新接觸刺激環(huán)境的條件恐懼。所有行為學(xué)實驗均在9∶00～15∶00進行，測量完畢后用75%乙醇將電擊箱擦拭干凈，清理干凈糞便、尿液及異味。

1.5.2 曠場實驗

第16天，小鼠藥物處理后，在實驗室環(huán)境下適應(yīng)1 h。實驗時將小鼠置于曠場箱（50 cm×50 cm×20 cm的銀色金屬敞箱）邊緣，記錄小鼠5 min內(nèi)進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)及時間（以小鼠軀干中心進入為準(zhǔn)）。

1.5.3 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮由2條金屬開臂和閉臂組成，每條開臂為30 cm×5 cm，周圍無遮擋；每條閉臂為30 cm×5 cm×15 cm。迷宮離地90 cm。第17天，將藥物處理的小鼠在實驗室環(huán)境下適應(yīng)1 h后，分別放于迷宮中央，面向開臂。記錄小鼠進入開臂的次數(shù)及時間（以小鼠軀干中心進入為準(zhǔn)）。觀測小鼠焦慮狀態(tài)，保持測試安靜，同時避免垂直強光照射。

1.5.4 爬梯實驗

實驗所用爬梯為內(nèi)置5階2.5 cm高樓梯的透明玻璃箱。第18天，將藥物處理小鼠在實驗室環(huán)境下適應(yīng)1 h后，背對臺階放于玻璃箱底部，記錄5 min內(nèi)小鼠爬梯數(shù)（四肢均爬上臺階）及站立次數(shù)（兩前肢均抬離臺階，后肢伸直）。

1.6 記錄小鼠在僵住實驗中排便的數(shù)量

第3，8和15天，記錄每只小鼠在5 min僵住實驗過程中的糞便數(shù)量。

1.7 ELISA法測定小鼠血清NE和5-HT含量

所有行為學(xué)實驗結(jié)束后，將各組小鼠ip給予1%戊巴比妥鈉（10 mL·kg-1）麻醉，心臟取血0.5 mL。使用高速冷凍離心機（4℃，1000×g）離心10 min，取血清，暫不使用的血清存于-80℃冰箱；參照試劑盒說明書方法使用ELISA試劑盒測量小鼠血清NE和5-HT含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有行為學(xué)數(shù)據(jù)使用動物行為觀測系統(tǒng)進行記錄，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS17.0軟件，計量資料以x±s表示，使用單因素方差分析（one-way ANOVA）及Studentt檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESJWT對PTSD模型小鼠體質(zhì)量的影響

模型組小鼠體質(zhì)量在第1～13天變化不大，之后才開始緩慢增加，其余各組小鼠體質(zhì)量隨時間延長逐漸升高（圖1）。整個實驗過程中，與正常對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量平均增長量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，舍曲林組小鼠體質(zhì)量平均增長量無顯著性差異，ESJWT組小鼠體質(zhì)量平均增長量明顯升高（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of extract of St.John′s wort tablets（ESJWT） on body mass of post-traumatic stress disorder（PTSD）model mice after short foot-shocks.PTSD Mouse model was established with inescapable short electric foot-shocks（2 d；15 times each day；intensity：0.8 mA；duration：10 s；interval：10 s）.From the first day before the electric foot-shock procedure，the mice were ig given sertraline（Ser，15 mg·kg-1）or ESJWT（25 mg·kg-1），once a day，for 18 d.n=12.＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.2 ESJWT對PTSD模型小鼠行為的影響

2.2.1 ESJWT對PTSD小鼠僵住時間百分比的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠在第3，8和15天僵住時間百分比顯著增加（P＜0.01），表明建模成功；與模型組比較，在第3，8和15天，舍曲林組和ESJWT組小鼠僵住時間百分比均明顯降低（P＜0.01）（圖2）。

2.2.2 ESJWT對PTSD模型小鼠進入曠場中央?yún)^(qū)域的次數(shù)和滯留時間的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠進入曠場中央?yún)^(qū)域的次數(shù)及時間均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，舍曲林組小鼠進入曠場中央?yún)^(qū)域的次數(shù)和時間均顯著增加（P＜0.01），ESJWT組小鼠進入曠場中央?yún)^(qū)域的次數(shù)和時間也顯著增加（P＜0.01）（圖3）。

Fig.2 Effect of ESJWT on freezing time of PTSD model mice after short foot-shocks.See Fig.1 for the mouse treatment.The percentage of freezing time of the mice was assessed on the 3rd，8thand 15thdays after electric foot-shocks procedure.，n=12.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.3 Effect of ESJWT on behavior of PTSD model mice after short foot-shocks.See Fig.1 for the mouse treatment.The number（A）and time（B）of central entries spent in the open field test on the 16thday after short foot-shocks.x±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model control group.

2.2.3 ESJWT對PTSD模型小鼠進入高架十字迷宮開臂的次數(shù)和滯留時間的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠進入開臂的次數(shù)和時間均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，舍曲林組小鼠進入開臂的次數(shù)和時間均顯著增加（P＜0.01），ESJWT治療組小鼠進入開臂的次數(shù)無顯著性差異，但進入開臂的時間增加（P＜0.05）（圖4）。

2.2.4 ESJWT對PTSD模型小鼠爬梯和站立次數(shù)的影響

各組小鼠爬梯次數(shù)無顯著性差異。與正常對照組比較，模型組小鼠站立次數(shù)明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，舍曲林組和ESJWT治療組小鼠站立次數(shù)均明顯減少（P＜0.01）（圖5）。

Fig.4 Effect of ESJWT on behavior of PTSD model mice after short foot-shocks.See Fig.1 for the mouse treatment.The open arm entries（A）and time（B）of the elevated plus maze test of the mice were assessed on the 17thday after electric foot-shocks proceduren=12.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.5 Effect of ESJWT on behavior of PTSD model mice after short foot-shocks.See Fig.1 for the mouse treatment.The number of steps（A）and rearing（B）was record?ed by the staircase test at the 18th day after electric foot-shocks procedure.n=12.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model control group.

2.3 ESJWT對PTSD模型小鼠在僵住實驗中排便數(shù)量的影響

在僵住實驗過程中，與正常對照組比較，第3，8和15天，模型組小鼠糞便量顯著增加（P＜0.01），第3和8天舍曲林組小鼠糞便量也顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，舍曲林組小鼠糞便量無顯著性差異，ESJWT組小鼠在第3，8和15天糞便量顯著降低（P＜0.01）（圖6）。

Fig.6 Effect of ESJWT on number of fecal pellets of PTSD model mice during freezing behavior test.See Fig.1 for the mouse treatment.n=12.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.4 ESJWT對PTSD模型小鼠血清NE和5-HT含量的影響

與正常對照組相比，模型組、舍曲林組和ESJWT治療組小鼠血清NE和5-HT含量均無顯著性差異（表1）。

Tab.1 Effect of ESJWT on serum contents of norepi?nephrine（NE）and 5-hydroxytryptamine（5-HT）of PTSD model mice after short foot-shocks

3 討論

本研究結(jié)果顯示，短暫電擊所致PTSD模型小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮、恐懼等PTSD樣行為，表明短暫電擊是比較簡便有效的建模方式。僵住實驗中小鼠不動時間百分比主要反映PTSD模型小鼠恐懼記憶的強弱，舍曲林組和ESJWT治療組小鼠僵住時間百分比較模型組均顯著降低，表明ESJWT與舍曲林作用相似，可有效預(yù)防PTSD模型小鼠恐懼記憶的產(chǎn)生。曠場實驗、高架十字迷宮實驗和爬梯實驗均能反映PTSD模型小鼠的焦慮程度，其中小鼠進入曠場中央?yún)^(qū)域以及進入高架十字迷宮開臂的次數(shù)與時間越少，表明小鼠越焦慮；爬梯實驗中小鼠站立的次數(shù)越多也表明小鼠越焦慮［18］。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，ESJWT治療組小鼠進入曠場中央?yún)^(qū)域的次數(shù)與時間均顯著增加，進入高架十字迷宮開臂的時間也明顯增加，同時爬梯實驗中站立的次數(shù)顯著降低，其作用與舍曲林相近，表明ESJWT能有效改善PTSD模型小鼠的焦慮行為。因此，行為學(xué)實驗可見，ESJWT能有效緩解短暫電擊所致PTSD模型小鼠的恐懼記憶與焦慮行為，療效與舍曲林相當(dāng)。

研究表明，PTSD模型小鼠除存在恐懼記憶與焦慮行為外，往往伴隨著體質(zhì)量減輕、攝食減少、糞便量增多等表現(xiàn)［19-20］。本研究結(jié)果顯示，短暫電擊所致PTSD模型小鼠體質(zhì)量在實驗前后無明顯變化，但在僵住實驗中，模型小鼠糞便量顯著增加；與模型組相比，舍曲林組小鼠糞便量無顯著性差異，而ESJWT治療組小鼠糞便量顯著降低。糞便量通常反映PTSD模型小鼠的恐懼反應(yīng)與緊張程度，表明ESJWT能有效緩解PTSD模型小鼠的恐懼反應(yīng)與緊張狀態(tài)。ESJWT有效改善模型小鼠的PTSD樣行為，可能與其多重抗抑郁作用有關(guān)。

ESJWT有效成分為金絲桃素和貫葉金絲桃素，能夠從多個方面改善PTSD模型小鼠焦慮和抑郁等行為。①能有效抑制突觸間隙5-HT，NE和DA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取，或直接與神經(jīng)遞質(zhì)受體結(jié)合，提高突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)濃度［21］；②ESJWT具有與抗抑郁藥物去甲丙咪嗪相同的作用，能夠降低大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞β2腎上腺素能的敏感性，同時還能減少細(xì)胞膜表面β1腎上腺素受體的密度并抑制下游的信號傳導(dǎo)，發(fā)揮其抗抑郁的作用［22］；③ 能夠調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺素軸（hypo?thalamic-pituitary-adrenal axis，HPA），具有對抗抑郁患者HPA亢進的作用［21］；④ 動物實驗發(fā)現(xiàn)，ESJWT能通過激活阿片類依賴途徑或抑制蛋白激酶C提高動物的疼痛閾值，發(fā)揮止痛作用［13］；同時還具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用，能夠減輕模型小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損害，并間接改善小鼠的焦慮、抑郁狀態(tài)。此外，大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在抑郁癥的治療中，ESJWT與SSRIs類藥物有相同的療效，且安全性更高［14］。同時從經(jīng)濟角度出發(fā)，ESJWT的成本更低，患者的依從性更好［15］，這或許為臨床防治PTSD提供了一種新的思路。

研究表明，PTSD患者體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE和5-HT的變化可能與PTSD的發(fā)病機制有關(guān)，NE和5-HT的含量與PTSD焦慮行為存在著直接的聯(lián)系，其中NE還參與PTSD患者恐懼記憶的鞏固［23-24］。Spivak等［25］研究發(fā)現(xiàn)，PTSD患者血漿NE和5-HT含量較正常人會發(fā)生明顯變化，NE含量升高且5-HT含量下降。本研究對PTSD模型小鼠血清NE和5-HT的含量進行了檢測。研究結(jié)果顯示，各組小鼠血清NE和5-HT含量無顯著性差異。據(jù)報道，在動物體內(nèi)一些藥物與神經(jīng)遞質(zhì)的濃度存在著周期性變化，不同時間點檢測可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果［26］。Yehuda等［27］認(rèn)為，PTSD模型小鼠的行為及體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的改變與建模方式有關(guān)，小鼠在經(jīng)歷應(yīng)激事件之后，為避免機體進一步損害會進行穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，使體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平維持正常。這些可能是導(dǎo)致本研究結(jié)果出現(xiàn)差異的主要原因。另外，Wilson等［28］在大鼠海馬與前額葉皮質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了5-HT含量下降、NE含量升高的現(xiàn)象，這與血漿中的變化一致。但由于本研究并未檢測腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，因此二者之間的聯(lián)系仍待進一步探討。

綜上所述，ESJWT可明顯改善PTSD模型小鼠行為的變化。由于其在臨床應(yīng)用中較SSRI類藥物更加經(jīng)濟實惠、安全有效，這為PTSD的防治提供了一種新的策略，但應(yīng)用于臨床治療仍需要更多的研究進行驗證。目前，ESJWT抗PTSD的作用機制尚不明確，有研究者認(rèn)為PTSD小鼠體內(nèi)炎癥水平的升高可能與PTSD的發(fā)病機制有關(guān)［29］，而ESJWT具有一定的抗炎作用［12］。因此，本課題組將對ESJWT對PTSD炎癥水平的影響進行進一步研究。

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