核桃青皮抑菌劑對葡萄病原真菌的抑制作用

尹向田 ，曲靜，張子文 ，湯小寧 *

（1.山東省葡萄研究院，山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250100；2.濟南文旅花木開發(fā)有限公司，山東 濟南 250100）

目前，我國核桃栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，隨著核桃種植面積地持續(xù)增加，核桃青皮污染日趨嚴重，這些青皮多數(shù)被倒在路旁、水溝邊，隨著雨水的沖刷，流進了江、河、湖泊、農(nóng)田等，對水資源和動植物的生存造成極大危害[1]。核桃青皮含有多種生物堿、鞣質(zhì)、多酚類、黃酮類、單寧類、香豆類、萜類、甾類和有機酸物質(zhì)等多種生理活性成分，還含有揮發(fā)油、脂肪酸、核桃多糖、胡桃醌及其衍生物等化學成分，具有一定的植物源農(nóng)藥活性。外皮中還含有較多的鉀元素，在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、色素提取等方面都有廣泛的應用[2,3]。

在發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品的今天，采用植物源殺菌劑在農(nóng)作物病蟲害防治中越來越受重視。相比化學殺菌劑，植物源抑菌劑兼具抑菌效果好和安全的特性。許牡丹等[4]用超聲波輔助法提取的薺菜多糖對鏈格孢菌有良好的抑菌活性，張苓花等[5]采用豆蔻浸提液用于草莓保鮮，抑菌率達69%以上。天然植物抑菌劑在食品、化妝品領(lǐng)域研究較多，在防治葡萄病害方面研究較少。對于葡萄病害的控制，目前除了加強田間管理外，使用較多的還是波爾多液、多菌靈、百菌清、甲基托布津、甲霜靈等化學藥劑[6,7]，利用核桃青皮中含有的活性物質(zhì)對葡萄病原菌產(chǎn)生抑制作用的研究鮮見報道。而當前對核桃青皮的研究也主要集中在提取有效活性物質(zhì)上，大多采用溶劑提取、減壓蒸餾、冷浸和熱回流等方法[8-10]，這些方法存在提取率低、能耗大等缺點，而對核桃青皮整體處理的研究和技術(shù)較少，將其資源化的實踐更少。本研究以廢棄的核桃青皮為原料，利用核桃青皮中含有種類較為豐富的對真菌具有抑菌活性的次生代謝物質(zhì)，研發(fā)出植物源殺菌劑，并研究其在葡萄生產(chǎn)上的防控技術(shù)，實現(xiàn)了核桃青皮廢棄物的資源化高效利用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄炭疽病菌（Gloeosporium fructigrum）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄枝枯病菌（Pestalotia menezesiana）、葡萄穗軸褐枯病菌（Alternaria viticola）、葡萄蔓枯病菌（Phomopsis viticola）、葡 萄潰 瘍 病 菌（Botryosphaeria dothidea）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、粉紅聚端孢（Trichothecium roseum）、 尖 鐮 刀 病 菌（Fusarium oxysporum）于山東省葡萄研究院良種與栽培研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。

1.1.3 材料與試劑

核桃采自山東省濟南市仲宮鎮(zhèn)核桃園村，試驗于2016年8月～2017年12月在山東省葡萄研究院進行。

硼酸硫酸鋅，分析純，購自于國藥化學試劑有限公司，多寧77%硫酸銅鈣可濕性粉劑，購自于江蘇龍燈化學有限公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮抑菌劑制備

將未使用乙烯利催熟劑脫皮的核桃鮮青皮使用榨汁機進行破碎、過濾后取清汁，進行真空濃縮5倍備用，濃縮壓力為0.08 MPa，溫度為75℃。濃縮后每1 L清汁中加入0.5 g硼酸和2.5 g硫酸鋅。

1.2.2 核桃青皮抑菌劑對指示真菌的抑制作用

采用菌絲生長速率法：將核桃鮮青皮抑菌劑與PDA培養(yǎng)基分別按1:5、1:10、1:50體積比混合，制作PDA平板，在平板中央接d=0.5 cm的指示菌菌碟，以未加抑菌劑的PDA培養(yǎng)基平板為對照，25℃下培養(yǎng)，每個處理重復3次，5 d后計算抑菌率，抑菌率的計算公式見式（1）。挑取處理及對照的病原菌菌絲，在光學顯微鏡下觀察無菌發(fā)酵液對菌絲形態(tài)的影響并進行拍照。

1.2.3 菌株GSBM05對葡萄白腐病的防治作用

選取健康的葡萄葉片，先用自來水沖洗干凈，再用75%酒精消毒，晾干后將葉片放入鋪有無菌濾紙的直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，加入無菌水保濕，每個處理葉片10片，重復3次。取葡萄白腐病菌的孢子懸浮液與核桃青皮抑菌劑10倍液等體積加入到離心管中混勻得到接種液，以市面上常用的多寧可濕性粉劑800倍液及無菌水作為對照。用消毒接種針在每個葉片刺傷4～5個傷口，在傷口處分別接種50 μL接種液，28℃保濕培養(yǎng)，每天進行病害統(tǒng)計并計算防治效果，計算公式見式（2）（3）。葉片病害分級方法：0級：無病斑；1級：病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級：病斑面積占整片葉面積的6%～15%以下；5級：病斑面積占整片葉面積的16%～25%以下；7級：病斑面積占整片葉面積的26%～50%以下；9級：病斑面積占整片葉面積的50%以上。

1.2.4 核桃青皮抑菌劑抑菌譜的測定

采用菌絲生長法，核桃青皮抑菌劑與PDA混合稀釋10倍測定其對10種供試病原菌的抑制作用，計算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮抑菌劑對葡萄白腐病菌的抑制作用

核桃青皮汁對葡萄白腐病菌的菌絲生長有強烈的抑制作用，并且抑制效果與濃度呈正相關(guān)。稀釋5倍、10倍、50倍的核桃青皮抑菌劑對白腐病菌的抑制率分別為100%、78.1%、50.8%。純濃縮汁的抑制率為70.1%。分別挑取對照和處理菌落邊緣菌絲置于顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后的菌絲嚴重畸形，菌絲斷裂、頂端膨大成球形，有的菌絲呈念珠狀。對照處理的菌絲生長正常，有明顯的分隔，無畸形現(xiàn)象。

圖1 核桃青皮抑菌劑對葡萄白腐病菌的抑制作用Fig.1 The inhibiting effect of antimicrobial agent of green walnut husk against grape white rot

2.2 核桃青皮抑菌劑對葡萄白腐病菌的防治效果

施藥后接種病原菌的3個處理中，核桃青皮抑菌劑10倍液和多寧800倍液的防治效果較好，發(fā)病率和防效分別為9.4%、94.6%和3.2%、96.7%。青皮汁的防治效果低于核桃青皮抑菌劑，但防治效果也在85%以上，可見，青皮汁本身對葡萄白腐病菌就有較好的防治效果，在經(jīng)過處理制成核桃青皮抑菌劑之后，防治效果更明顯。

圖2 核桃青皮抑菌劑處理后葡萄白腐病菌菌絲生長情況Fig.2 The growth of the mycelium of grape white rot treated with antimicrobial agent of green walnut husk

表2 核桃青皮抑菌劑對葡萄離體果實白腐病的防治效果Table 2 The control effect of antimicrobial agent of green walnut husk against on vitro grape fruit

2.3 核桃青皮抑菌劑抑菌譜測定

測定結(jié)果表明，核桃青皮抑菌劑稀釋10倍后對10種供試植物病原真菌具有不同的抑菌活性，具體見表3。其中，對葡萄白腐病菌和粉紅聚端孢的抑菌活性最強，分別為99.2%和100%。其次對葡萄灰霉病菌和立枯絲核菌的抑菌率也較強，均為88%以上，對葡萄枝枯病菌和葡萄炭疽病菌的抑菌率較差，分別為10.1%、34.9%。對其它病原菌的抑菌率在53.4%～72.3%之間。

表3 核桃青皮抑菌劑抑菌譜測定Table 3 Antagonistic activity of antimicrobial agent of green walnut husk against fungi direction

3 討論

本研究研制成核桃青皮抑菌劑中，硼、鋅是葡萄生長的重要元素，具有營養(yǎng)作用，還具備抑菌的作用。羅錦等[11]研究表明，外源硼酸對柑橘采后病害有良好的防治效果，周毅等[12]發(fā)現(xiàn)，硫酸鋅處理后能刺激玉米種子中物質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進養(yǎng)分積累。核桃青皮抑菌劑制備中選用的螯合劑為亞氨基二琥珀酸四鈉IDS，它是新近出現(xiàn)的新型氨基酸基螯合劑，與EDTA、DTPA和NTA等同屬氨基多羧酸類螯合劑的替代產(chǎn)品，環(huán)保高效，易溶于水，易吸收，無拮抗作用，是一種新型綠色環(huán)保的絡合劑[13]。

本試驗制備的核桃青皮抑菌劑對葡萄白腐病菌等多種葡萄相關(guān)的病原菌均具有良好的抑制作用，這在國內(nèi)研究尚屬首次。核桃青皮抑菌劑的研制不僅合理有效的解決了核桃青皮對環(huán)境的污染，變廢為寶，保護和改善了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，獲得了生態(tài)效益，而且還開發(fā)出了高附加值的產(chǎn)品，有較高的經(jīng)濟效益。